Login processing...

JoVE Journal
Genetics

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Genetics

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Journal (Genetics)

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Journal (Genetics)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Click here for the English version

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Article DOI: 10.3791/57747

September 18th, 2018 •

Heather M. Kudyba*^1,2, David W. Cobb*¹, Anat Florentin^1,2, Michelle Krakowiak¹, Vasant Muralidharan^1,2

¹Department of Cellular Biology, University of Georgia, ²Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 18th, 2018

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi beskriver en metod för att skapa glmS-baserat villkorlig knockdown mutanter i Plasmodiumfalciparum använder CRISPR/Cas9 gen editering.

Transcript

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i biologin hos den mänskliga malariaparasiten, P.Falciparum, genom att hjälpa till att avslöja proteinfunktion genom villkorlig knockdown. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör relativt lätt generering av villkorliga mutanter jämfört med tidigare metoder. Till att börja med går du till Chop Chop och väljer Fasta Target'Under Target, klistra in 200 baspar från de tre främsta slutet av den öppna avläsningsramen för en gen och 200 baspar från början av genens tre främsta UTR.

Under In'select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next klickar du på Sök målplatser'Välj en gRNA-sekvens bland de presenterade alternativen, vilket ger företräde åt det mest effektiva gRNA som är närmast platsen för ändring och som har minst antal platser utanför målet. Köp gRNA-sekvensen och dess omvända komplement som polyakrylamidgelelektrofores renad oligos. Den gRNA-sekvens som används för att rikta pfh-sp70x finns i textprotokollet.

Tillsätt 40 mikrogram vardera av pMK-U6, pUF1-Cas9, och pHA-glmS DNA i ett sterilt 1,5 millimeters centrifugrör. Tillsätt en tiondel av volymen av DNA av tre molar natriumacetat i vatten till röret och blanda det väl med hjälp av en virvel. Tillsätt sedan 2,5 gånger volymen av 100 procent etanol till röret och blanda det väl med hjälp av en virvel i minst 30 sekunder.

Placera röret på is eller vid minus 20 grader Celsius i 30 minuter. Sedan centrifug röret vid 18, 300 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugeringen avlägsnas supernatanten försiktigt från röret utan att pelleten störs.

Tillsätt tre gånger volymen av 70 procent etanol till röret och blanda den kort med hjälp av en virvel. Centrifugera röret vid 18, 300 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Återigen, ta försiktigt bort supernatanten från röret utan att störa pelleten.

Låt röret vara öppet och låt pelleten lufttorka i 15 minuter. Förvara det utfällda DNA:t vid minus 20 grader Celsius tills det behövs för transfection. Till transfect RBCs, förbereda 1X cytomix buffert samt ofullständiga och kompletta RPMI som beskrivs i textprotokollet.

Filtrera sterilisera bufferten med hjälp av ett 0,22 mikronfilter. Tillsätt 380 mikroliter av 1X cytomix till DNA och virvel för att lösa upp. Låt DNA:t lösas upp i 1X cytomixen i 10 minuter, virvelning var tredje minut i 10 sekunder.

I en steril, 15 milliliter koniska rör, kombinera 300 mikroliter av isolerade mänskliga RBCs i den ofullständiga RPMI med fyra milliliter av 1X cytomix. Centrifugera RBC:erna vid 870 gånger G i tre minuter. Ta sedan bort supernatanten från RBC-pelleten.

Åter upphäva RBC pelleten med DNA-cytomix blandningen och överföra den till en 0,2 centimeter elektroporation cuvette. Porera RBC:erna med hjälp av de villkor som anges i textprotokollet. Efter elektroporation, överför innehållet från cuvette till ett 15 milliliter koniskt rör som innehåller fem milliliter av komplett RPMI.

Centrifugera röret vid 870 gånger G i tre minuter vid 20 grader Celsius. Sedan, dekantera supernatanten. Nu, åter upphäva pelleten i fyra milliliter av komplett RPMI och överföra till en brunn i en sex-väl vävnad kultur tallrik.

Lägg till 400 mikroliter av en hög schizontkultur till de överförda RBC:erna. Underhåll alla kulturer vid 37 grader Celsius under tre procent syre, tre procent CO2 och 94 procent kväve. Nästa dag, tvätta kulturen med fyra milliliter av komplett RPMI.

Centrifugera kulturen på 870 gånger G i tre minuter. Aspirera supernatanten. Åter avbryta kulturen i fyra milliliter av komplett RPMI.

48 timmar senare, tvätta kulturen med fyra milliliter av komplett RPMI. Sedan åter upphäva kulturen i komplett RPMI som innehåller en mikromolar DSM1 att välja för Cas9 plasmid. Efter denna punkt, ersätta odlingsmediet med färska kompletta RPMI plus en mikromolar DSM1 varje 48 timmar.

Fortsätt tvätta kulturerna varje dag med komplett RPMI tills parasiter inte längre är synliga av blodsutstryk. För att göra ett blodutstryk, pipettera 150 mikroliter av kultur i en 0,6 milliliter centrifugrör. Efter pelletering av cellerna genom centrifugeringen vid 1, 700 gånger G i 30 sekunder, aspirera bort supernatanten.

Använd en pipett för att överföra de pelleterade cellerna till en glasrutschkana. Med hjälp av en andra glasrutschbana som hålls i 45 graders vinkel mot den första bilden, smeta bloddropparet. Fläcka in rutschkanan med hjälp av en färgningssats i kommersiellt sett enligt tillverkarens protokoll.

Visa parasiterna med hjälp av 100 gånger olje-nedsänkning mål. Början fem dagar post-transfection, ta bort två milliliter av kulturen med RBCs åter uppskjutna i odlingsmediet. Lägg tillbaka två milliliter färskt medium och blod på två procent hematokrit.

Tillsätt färskt blod på detta sätt en gång i veckan tills parasiten återkommer, som bestäms av tunt blod utstryk. Utför serieutspädningar av parasitkulturen för att uppnå en slutlig koncentration av 0,5 parasiter per 200 mikroliter. Tillsätt 200 mikroliter av den utspädda kulturen till brunnarna i en 96-väl vävnadskulturplatta.

Underhåll kloningsplattan tills parasiter är detekterbara i brunnarna. Var 48:e timme, byt ut mediet i 96-brunnsplattan med färskt medium. En gång i veckan, med början fem dagar efter början kloningsplattan, ta bort 100 mikroliter från varje brunn och lägga tillbaka 100 mikroliter av färskt medium plus blod.

För att identifiera eventuella brunnar som innehåller parasiter, placera 96-brunnsplattan i 45 graders vinkel i cirka 20 minuter, vilket gör att blodet kan bosätta sig i en vinkel inom plattan. Placera sedan 96-brunnsplattan på en ljuslåda. Lägg märke till att brunnarna som innehåller parasiter innehåller media som är gult i färg, jämfört med de rosa medierna av parasitfria brunnar, på grund av försurning av mediet av parasiterna.

Med hjälp av en serologisk pipett, flytta innehållet i de parasithaltiga brunnarna till en 24-väl-vävnadskulturplatta för att möjliggöra expansion av parasitmien. Med hjälp av PCR-analys, kontrollera dessa klonala parasit linjer för korrekt integration. Resultaten av en immunofluorescens analys visas här, visar framgångsrikt HA märkning av PfH-sp70x.

PfH-sp70x glmS parasiter var fasta och färgas med DAPI som en kärna markör, liksom antikroppar mot HA. Membran-associerade histidin rika protein en, en markör för protein export till värden RBC. En Western Blot-analys av PfH-sp70x proteinnivå efter behandling med glukosamin visas här. Som förväntat minskar proteinnivån under behandlingstiden.

Denna teknik banar väg för forskare inom området parasitologi för att undersöka grundläggande frågor i malariaparasitens biologi. Det är viktigt att komma ihåg att P.Falciparum är en blodburen patogen och lämplig personlig skyddsutrustning bör bäras när du utför detta förfarande.

X

Simple Hit Counter