Login processing...

JoVE Journal
Genetics

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Genetics

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Journal (Genetics)

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Journal (Genetics)

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Click here for the English version

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Article DOI: 10.3791/57747

September 18th, 2018 •

Heather M. Kudyba*^1,2, David W. Cobb*¹, Anat Florentin^1,2, Michelle Krakowiak¹, Vasant Muralidharan^1,2

¹Department of Cellular Biology, University of Georgia, ²Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 18th, 2018

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi beskriver en metode til at generere glmS-baseret betinget knockdown mutanter i Plasmodium falciparum bruger CRISPR/Cas9 genom-redigering.

Transcript

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i biologi af den menneskelige malaria parasit, P Falciparum, ved at hjælpe med at afdække protein funktion gennem betinget knockdown. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver mulighed for relativt let generering af betingede mutanter sammenlignet med tidligere metoder. Til at begynde med skal du gå til Chop Chop og vælge Fasta Target'Under Target, indsætte de 200 basepar fra de tre primære ende af den åbne læseramme af et gen og 200 basepar fra starten af genets tre primære UTR.

Under In'select P.Falciparum'og vælg CRISPR/Cas9'under Using'Next, klik på Find destinationswebsteder'Vælg en gRNA-sekvens fra de viste indstillinger, hvilket giver fortrinsret til det mest effektive gRNA, der er tættest på ændringsstedet, og som har færrest off-target-websteder. Køb gRNA-sekvensen og dens omvendte komplement som polyacrylamidgelelektrophoresis renset oligos. Den gRNA-sekvens, der bruges til at målrette PfH-sp70x, findes i tekstprotokollen.

Der tilsættes 40 mikrogram hver pMK-U6, pUF1-Cas9 og pHA-glmS DNA i et sterilt 1,5 millimeter centrifugerør. Tilsæt en tiendedel af mængden af DNA af tre molar natriumacetat i vand til røret og bland det godt ved hjælp af en vortex. Derefter tilsættes 2,5 gange mængden af 100 procent ethanol til røret og bland det godt ved hjælp af en vortex i mindst 30 sekunder.

Placer røret på is eller ved minus 20 grader Celsius i 30 minutter. Derefter centrifuge røret ved 18, 300 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering fjernes supernatanten forsigtigt fra røret uden at forstyrre pellets.

Tilføj tre gange volumen på 70 procent ethanol til røret og bland det kort ved hjælp af en vortex. Centrifuge røret ved 18, 300 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Igen, forsigtigt fjerne supernatant fra røret uden at forstyrre pellet.

Lad røret stå åbent og lad pellet lufttørre i 15 minutter. Opbevar det udfældede DNA ved minus 20 grader Celsius, indtil det er nødvendigt for transfektion. Til transfect RBC' er 1X cytomixbuffer samt ufuldstændig og komplet RPMI som beskrevet i tekstprotokollen.

Filter sterilisere bufferen ved hjælp af et 0,22 mikronfilter. Tilføj 380 mikroliter af 1X cytomix til DNA og vortex at opløse. Lad DNA'et opløses i 1X cytomix i 10 minutter, mens du hvirvler hvert tredje minut i 10 sekunder.

I et sterilt, 15 milliliter konisk rør, kombinere 300 mikroliter af isolerede menneskelige RBCs i den ufuldstændige RPMI med fire milliliter 1X cytomix. Centrifuge rbcs på 870 gange G i tre minutter. Fjern derefter supernatanten fra RBC-pellet.

Re-suspendere RBC pellet med DNA-cytomix blandingen og overføre den til en 0,2 centimeter elektroporation cuvette. Porere RBC'erne ved hjælp af de betingelser, der er angivet i tekstprotokollen. Efter elektroporation overføres indholdet fra cuvette til et konisk 15 milliliterrør indeholdende fem milliliter komplet RPMI.

Centrifuge røret ved 870 gange G i tre minutter ved 20 grader Celsius. Derefter dekantere supernatant. Nu, re-suspendere pellet i fire milliliter komplet RPMI og overføre til en brønd i en seks-godt væv kultur plade.

Tilføj 400 mikroliter af en høj schizont kultur til de overførte RBCs. Opretholde alle kulturer på 37 grader Celsius under tre procent ilt, tre procent CO2, og 94 procent kvælstof. Den næste dag, vaske kulturen med fire milliliter komplet RPMI.

Centrifuge kulturen på 870 gange G i tre minutter. Aspirate supernatant. Re-suspendere kulturen i fire milliliter komplet RPMI.

48 timer senere vaskes kulturen med fire milliliter komplet RPMI. Derefter re-suspendere kulturen i komplet RPMI indeholder en micromolar DSM1 at vælge til Cas9 plasmid. Efter dette punkt skal du erstatte kulturmediet med frisk komplet RPMI plus en mikromolar DSM1 hver 48 timer.

Fortsæt med at vaske kulturerne hver dag med komplet RPMI, indtil parasitter ikke længere er synlige ved blod smear. For at gøre en blod smear, pipette 150 mikroliter af kultur i en 0,6 milliliter centrifuge rør. Efter pelletering af cellerne ved centrifugering ved 1, 700 gange G i 30 sekunder, aspirere supernatanten af.

Brug en pipette til at overføre de pelleterede celler til et glasdias. Brug en anden glas dias holdt i en 45 graders vinkel til det første dias, smøre bloddråber. Pletten diaset ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt farvningssæt i henhold til producentens protokol.

Se parasitterne ved hjælp af 100 gange olie-nedsænkning mål. Begyndende fem dage efter transfektion, fjerne to milliliter af kulturen med RBCs re-suspenderet i kulturmediet. Tilføj tilbage to milliliter frisk medium og blod på to procent hæmatokrit.

Tilføj frisk blod på denne måde en gang om ugen, indtil parasitten igen, som bestemt af tynde blod smøre. Udfør seriel fortyndinger af parasitkulturen for at opnå en endelig koncentration på 0,5 parasitter pr. 200 mikroliter. Tilføj 200 mikroliter af den fortyndede kultur til brøndene i en 96-brønd vævskulturplade.

Vedligehold kloningspladen, indtil parasitter kan påvises i brøndene. Hver 48 timer, erstatte medium i 96-godt plade med frisk medium. En gang om ugen, begyndende fem dage efter begyndelsen af kloning plade, fjerne 100 mikroliter fra hver brønd og tilføje tilbage 100 mikroliter af frisk medium plus blod.

For at identificere eventuelle brønde, der indeholder parasitter, placere 96-brønd plade i en 45 graders vinkel i ca 20 minutter, så blodet til at bosætte sig i en vinkel i pladen. Derefter placere 96-brønd plade på en lyskasse. Bemærk, at brøndene, der indeholder parasitter indeholder medier, der er gul i farven, i forhold til de lyserøde medier af parasit-fri brønde, på grund af forsuring af mediet af parasitter.

Ved hjælp af en serologisk pipette skal du flytte indholdet af de parasitholdige brønde til en 24-brønd vævskulturplade for at muliggøre udvidelse af parasitæmien. Brug PCR analyse, kontrollere disse klonale parasit linjer for korrekt integration. Resultaterne af en immunofluorescens assay er vist her, viser en vellykket HA tagging af PfH-sp70x.

PfH-sp70x glmS parasitter blev rettet og farves med DAPI som en kernemarkør, samt antistoffer mod HA. Membran-associeret histidin rige protein en, en markør for protein eksport til værten RBC. En Western Blot analyse af PfH-sp70x protein niveau efter behandling med glucosamin er vist her. Som forventet falder proteinniveauet i løbet af behandlingen.

Denne teknik baner vejen for forskere inden for parasitologi til at undersøge grundlæggende spørgsmål i biologi malaria parasitten. Det er vigtigt at huske, at P.Falciparum er et blodbårent patogen, og at der skal bæres passende personlige værnemidler, mens du udfører denne procedure.

X

Simple Hit Counter