Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av Trypanosoma cruzi med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet
Chapters
Summary July 31st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här beskriver vi ett protokoll för att introducera en gen knockout i den extracellulära amastigote av Trypanosoma cruzi, med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet. Tillväxten fenotyp kan följas upp antingen genom cellräkning av axenic amastigote kultur eller genom spridning av intracellulära amastigotes efter värd cell invasion.
Transcript
det är svårt att använda värd infektion skede av T.cruzi i experiment eftersom amastigote är en obligate intracellulär parasit. Vår odlingsteknik gör det möjligt för amastigote att tillfälligt replikera utanför värdcellen, så vi kan utföra experiment direkt på detta kliniskt relevanta stadium av parasiten. Demonstrerar proceduren blir Yukie Akutsu, en tekniker från vårt institut.
Upprätthålla en värd parasit samkultur enligt manuskriptet riktningar. När Cas9-expresserande parasiten är redo för differentiering, samla supernatanten i ett koniskt rör och kontrollera om provkvaliteten finns under ett mikroskop. Om det finns ett betydande antal extracellulära amastigotes, utför en swim-out förfarande för att isolera trypomastigotes.
Snurra ner blandningen av trypomastigotes och amastigotes i femton minuter som 2, 100 gånger G.Then kassera de flesta av supernatanten och lämna 0,5 till 1 milliliter medium i röret. Löst locket röret, och inkubera pelleten vid 37 grader Celsius i en till två timmar, vilket gör det möjligt för de aktiva trypomastigotes att simma ur pelleten. Efter inkubationen överför du supernatanten med trypomastigotesen till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.
Snurra ner den, och återanvänd pelleten med 5 milliliter DMEM. Överför parasiten till en T-25-odlingskolv och inkubera kolven i 37 grader Celsius under 5 %koldioxid i en befuktad inkubator. Omkring 95%av parasiterna kommer att differentiera till amastigotes efter 24 timmar.
Centrifugera kulturen av extracellulära amastigotes i 15 minuter vid 2, 100 gånger G, och kasta supernatanten. Resuspend pelleten med elektroporationsbuffert som innehåller tillhandahållen tilläggslösning till en slutlig celltäthet på en gång 10 till 8:e cellerna per milliliter. Aliquot 100 mikroliter av de resuspended parasiterna i 1,5 liters microcentrifug rör.
Tillsätt sedan fem till 10 mikrogram Guide RNA, och blanda försiktigt genom pipettering. Överför blandningen till en två millimeter gap electroporation cuvette, och tillämpa en puls med elektroporation enheten. Sedan överför cuvette innehållet i en T-25 kolv, som innehåller fem milliliter av förvärmda LIT medium, lämna locket löst, och inkubera kolven på 37 grader Celsius under 5%koldioxid.
Övervaka celltillväxten antingen genom fortsättning av axenic odling eller som intracellulära amastigotes efter värd cell infektion. Om övervakning av celltillväxten som axenic amastigotes, försiktigt skaka kolven för att återanvända extracellulära amastigotes i lösningen, och blanda 20 mikroliters av kulturen med en mikroliter av propidiumjodidlösning i ett mikrocentrifugrör. Det är viktigt att inte låta odlingskolven stå utanför inkubatorn längre än nödvändigt eftersom temperaturen är en av de faktorer som möjliggör yxisk proliferation av amastigote.
Applicera provet på en hemocytometer, och observera det under fluorescensmikroskop. Räkna sedan antalet livskraftiga amastigotes som inte färgas av propidiumjodid. För att övervaka tillväxten av knockout celler som intracellulära amastigotes, utsäde värd 3T3 celler i en 12-brunns platta med DMEM.
En dag efter electroporation samla knockout amastigotes genom centrifugeringen, kassera supernatanten och resuspend parasiterna med två milliliter av DMEM. Ta bort mediet från värdcellkulturen och lägg till de återanvända amastigotesna. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid i två dagar, vilket gör det möjligt för amastigotes att etablera en infektion.
Efter de två dagarna, tvätta bort de extracellulära amastigotes utanför värdceller med DMEM, och tillsätt färsk DMEM. Fortsätt inkubationen i ytterligare två dagar, och visualisera sedan kärnorna i värdcellerna och de intracellulära amastigotesna. Det har visats att T.Cruzi amastigotes transfected med Guide RNA mot den väsentliga genen TcCGM1 uppvisar en betydande tillväxtdefekt jämfört med en kontrollgrupp.
Vid övervakning av tillväxt som intracellulära amastigotes är den fraktion av värdkärnor som är associerade med T.Cruzi-kärnor betydligt lägre i utslagsgruppen TcCGM1 jämfört med kontrollen. Transfektion av Guide RNA mot ett av paraflagellarstavsproteinerna TcPAR1 påverkar tvärtom inte signifikant celltillväxten efter fyra dagars axensk kulturing eller hämmar tillväxten av intracellulära amastigotes. Men fem dagar efter infektion, antalet trypomastigotes som framträder ur värdcellen är betydligt lägre i TcPAR1 knockout co-kultur jämfört med kontrollen samkultur.
Vidare verkade de differentierade trypomastigotesna inuti värdcellen i kontrollgruppen mer aktiva än de i knockout-gruppen. Denna metod kan också användas för att studera effekterna av exogena gener på amastigote stadium istället för transfecting Guide RNA till Cas9-uttrycker amastigote, du kan transfekt plasmiden till en vild-typ amastigote att uttrycka en exogen gen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
