Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Co-immunoprecipitation analyse til at studere funktionel interaktioner mellem receptorer og enzymer

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Journal (Immunology and Infection)

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Journal (Immunology and Infection)

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Click here for the English version

Co-immunoprecipitation analyse til at studere funktionel interaktioner mellem receptorer og enzymer

Article DOI: 10.3791/58433

September 28th, 2018 •

Michael Peled¹, Marianne Strazza², Adam Mor²

¹Pulmonary Department, The Chaim Sheba Medical Center, ²Columbia Center for Translational Immunology, Department of Medicine, Columbia University Medical Center

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 28th, 2018

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi præsenterer her, en protokol for co-immunoprecipitation og en på perle enzymatisk aktivitet assay samtidig undersøge specifikke protein domæner af plasmamembran receptorer for både enzym rekruttering og enzymaktivitet bidrag.

Transcript

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i cellesignaleringsområdet, såsom betydningen af forskellige proteindomæner i receptorenzyminteraktion og enzymatisk aktivering. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for samtidig testning af receptorenzym interaktioner og de funktionelle konsekvenser af denne interaktion på enzymaktiviteten. For hver plade anvendes 10 milliliter DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin og streptomycin.

Dagen før transfektion, frø menneskelige embryonale nyre 293-T-celler i 12 10-centimeter plader ved hjælp af et hæmocytometer til at tælle cellerne. Inkubere ved 37 grader Celsius i 5%C02. Når cellerne er 80 til 90% sammenløb, skal du bruge et lipidbaseret transfektionsmiddel til at transfect fem af pladerne.

Udføres transfektionen efter producentens anvisninger for klæbende celler i 10 centimeter plader. Derefter transfect et identisk andet sæt af fem plader sammen med en ekstra plade tjener som en ikke-transmitteret kontrol til måling af udtrykt protein mængde før immunoprecipation. Inkuber de transficerede plader i en vævskulturinkubator ved 37 grader Celsius i 5% CO2 i 48 timer.

Brug et fluorescerende mikroskop til at undersøge cellerne for GFP-udtryk og sikre, at transinfektionen er opstået. Bland 15 mikroliter af 100-millimolar natriumortovanadat med 50 mikroliter på 30% hydrogenperoxid for at forberede en frisk pervanadat blanding. Hvis du vil fosforlate de mærkede versioner af PD-1, skal du fjerne mediet fra de transfrætede CELLER pd-1-GFP.

Der tilsættes 10 milliliter almindeligt DMEM og 10 mikroliter pervanadat til hver plade. Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter. Herefter vaskes cellerne tre gange i iskold PBS med fem milliliter PBS pr. vask.

Under immunoprecipation, bør alle trin udføres enten på is eller ved fire grader Celsius. Suppler lysisbufferen med proteasehæmmere ved at opløse en tablet af inhibitorerne i 10 milliliter buffer. Også tilføje en millimolar natrium orthovanadate til buffer, der vil blive brugt på PD-1-GFP transficerede plader.

Der tilsættes 500 mikroliter iskold lysisbuffer til cellerne, og sørg for at tilføje lysisbufferen, der indeholder natriumortovanadatet, til kun de plader, der indeholder PD-1-GFP-transficerede celler. Brug en celleskraber til straks at fjerne og indsamle cellerne fra pladerne. Lysaterne overføres til 1,5 milliliter kolde rør og drej dem ved 0,005 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 30 minutter.

For at indsamle post-kerner supernatant fra lysates, spin dem ned på 10, 000 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i 10 minutter. Overfør supernatanterne i nye rør og kassér pellet. Opbevar supernatanterne i andet sæt af seks plader på is til senere WCL-analyse.

For at begynde at forberede anti-GFP perler, forsigtigt ryste flasken indeholder perlerne før åbning for at forhindre afregning. Fjern 40 mikroliter af anti-GFP perler fra gyllen pr hver tilstand. Centrifuge ved 500 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i tre minutter.

Fjern supernatanten for at vaske perlerne, og sørg for at minimere kontakten mellem pipetten og perlerne for at forhindre tab. Resuspend perlerne i 80 mikroliter lysis buffer pr prøve. Tilsæt de vaskede perler direkte til cellen lysate fra PD-1-GFP-udtryk celler i det første sæt af fire plader.

Roter ved 0,005 gange tyngdekraften i 30 minutter ved fire grader Celsius til immunoprecipitat de GFP-mærkede proteiner. Vask perlerne tre gange med en milliliter kold lysis buffer, der ikke indeholder orthovanadate for hver vask. Derefter centrifuge på 2, 500 gange tyngdekraften i 10 sekunder.

Opdel lysatet af den aktive SHP2 fra det første sæt plader i tre lige store portioner og tilsæt en del til hver af de tre rør, der indeholder de vaskede PD-1-GFP-holdige perler. Der tilsættes 1/3 af lysatevolumenet fra de ikke-transmittede celler til det andet rør af vildtypen PD-1-GFP perler. Kassér den resterende 2/3.

Inkuber perlerne i fire timer ved fire grader Celsius med blid rotation ved 0,005 gange tyngdekraften. Herefter vaskes perlerne to gange med en milliliter kold lysisbuffer for hver vask. Der tilsættes 80 mikroliter lysisbuffer til hver prøve, hvilket sikrer, at det samlede volumen i hvert rør er 100 mikroliter.

Ved hjælp af en cut pipette spids, pipette forsigtigt op og ned for at blande. Overfør derefter 50 mikroliter fra hvert rør i to friske, 1,5 milliliterrør. Vask perlerne én gang med fosfatase vask buffer.

Fjern derefter supernatanten helt. Tilsæt 100 mikroliter af analyse buffer til perlerne og inkubere ved 30 grader Celsius i 30 minutter under blid omrøring. Når bufferen bliver gul, skal reaktionen afsluttes ved at tilsætte 50 mikroliter af en molæreopløsning af natriumhydroxid.

Centrifuge ved 2,500 gange tyngdekraften i 10 sekunder. Derefter overføres supernatanten til to brønde af halvt område i en 96-brønd plade. Læs absorberene ved 405 nanometer og udtrykke resultaterne som relativ optisk tæthed over kontrol wild-type version af PD-1-GFP.

Først spin ned perlerne på 2, 000 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i 30 sekunder og fjern supernatant. Tilsæt 20 mikroliter af to gange Laemmli buffer og kog ved 95 grader Celsius i fem minutter. Ved hjælp af et BCA-sæt måles proteinkoncentrationen i inputkontrollerne.

Overfør 30 mikroliter af den mest fortyndede prøve til et nyt rør. Brug lysisbuffer til at fortynde resten af inputkontrollerne til samme koncentration som den mest fortyndede prøve. Overfør derefter 30 mikroliter af hver af de fortyndede inputkontroller til et nyt rør.

Tilføj lige store mængder af to gange Laemmli buffer til lysates og kog dem 95 grader Celsius i fem minutter. Derefter drejer du perlerne ned ved 2,000 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i 30 sekunder, før de udfører Western Blot-analyse som beskrevet i tekstprotokollen. I denne undersøgelse udvikles en kombineret co-immunoprecipitation og enzymatisk aktivitetsanalyse til parallel vurdering af receptorenzyminteraktioner og aktivering.

Ikke overraskende, SHP2 undladt at binde sig til PD-1, når ITSM blev muteret. Bemærkelsesværdigt, den mutante version af ITIM hæmmet SHP2 bindende kun i begrænset omfang. Ikke desto mindre viser SHP2-fosfataseaktivitetsanalysen, at ITIM og ITSM er lige så uundværlige for enzymatisk aktivitet.

Dette afslører en to-trins aktivering model, hvor SHP2 er foldet ind i en autoinhibited kropsbygning under hvileforhold. Ved aktivering af PD-1 rekrutteres SHP2 til den fosforylerede ITSM. ITIM skal imidlertid også fosforyleres for at udfolde SHP2 til sin aktive kropsbygning.

Efter dens udvikling, denne teknik kan bane vejen for forskere inden for celle signalering at udforske funktionen af protein domæner i receptor-enzym interaktioner.

X

Simple Hit Counter