16,275 Views
•
05:03 min
•
October 29, 2018
DOI:
Transcript
Automatically generated
שיטה זו מספקת כלי אבחון מהיר ואמין לזיהוי Bemisia tabaci, מזיק חרקים פולשני המשפיע על ייצור ירקות וגידולי נוי במדינות רבות ברחבי העולם. בשל קלותה, ניתן לבצע את השיטה באתר ישירות בנקודות כניסה למוצרים ליבוא צמחים, כגון נמלים ושדות תעופה, ובכך יש פוטנציאל לצמצם את הפיזור של Bemisia tabaci לאורך רשתות המסחר. כדי להתחיל, השתמש במספריים כדי לחתוך רצועת LAMP שמונה צינור לשתיים, ארבע צינורות LAMP רצועות.
לאחר מכן, תייג את הצינורות לפי הערכה המתוארת איור אחד של פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להכין מספיק B.tabaci LAMP תגובה מאסטר לערבב עבור 80 תגובות. לאחר מכן, לוותר על 22.5 microliters של תערובת האב לתוך כל הצינורות של רצועות LAMP ארבע צינורות.
דופק צנטריפוגה, ולשים אותם על קרח. במהירות מערבולת ודופק צנטריפוגה B.tabaci LAMP PAC. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים לצינור המסומנים PAC בכל אחת מרצועות ה-LAMP עם ארבעת הצינורות.
לאחר מכן, סגרו את העפעפיים, ואחסנו את יחידות ערכת B.tabaci LAMP המוכנות לשימוש במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהפקת דנ”א, השתמש בקיסמים סטריליים כדי להעביר את דגימות החרקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיליליטר עם 30 מיקרוליטרים של פתרון מיצוי DNA. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס ב ThermoMixer להגדיר 300 סל”ד.
בקצרה מערבולת וצנטריפוגה הדופק הדגימות. הפשרו את אחת הערכות המוכנות לשימוש של B.tabaci LAMP. לאחר מכן, מערבולת הערכה במהירות, ודופק צנטריפוגה זה.
הוסף 2.5 מיקרוליטרים של תמצית DNA מדגם לצינורות S-1 ו- S-2. לאחר מכן, להוסיף 2.5 microliters של פתרון מיצוי DNA אלקליין טהור לצינור NAC. לאחר מערבולת וצנטריפוגה דופק הערכה, להכניס את הערכה לתוך מכשיר ניתוח LAMP, ולבצע ניתוח הגברה DNA isothermal ב 65 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
באותה ריצה, לבצע ניתוח טמפרטורת התכה של מוצרי הגברה DNA על ידי חימום הראשון את הערכה ל 98 מעלות צלזיוס וקירור אותו ל 75 מעלות צלזיוס. אמת את קריאת LAMP באמצעות יישום האימות האוטומטי LAMP. תחילה, הגדר את מיני היעד ואת מספר הדגימות שנבדקו לפני לחיצה על לחצן צור דוח.
לבסוף, העבר את הקריאה לשדות הקלט המתאימים של יישום האימות. מיד לאחר הזנת הנתונים תוצג תוצאת האימות. בפרוטוקול זה, דגימות חרקים B.tabaci יורטו במהלך תהליך בקרת היבוא השוויצרי הרגיל נותחו באמצעות מראי LAMP.
מתוך סך של 80 דגימות שנותחו, 75 דגימות זוהו כראוי כחיוביות אמיתיות, ושתי דגימות זוהו כראוי כשליליות אמיתיות. שלוש דגימות, לעומת זאת, היו שליליות שווא וזוהו באופן שגוי כמו לא להיות B.tabaci. תת-קבוצה של הראיה בוצעה באתר על ידי פקחי בריאות המפעל בנמל התעופה של ציריך.
בתוצאות הייצוגיות זוהו נכון דגימות 1 ו-2 כ-B.tabaci באמצעות הגברה בדנ”א לאחר כ-30 דקות בטמפרטורת חישול צפויה של כ-82 מעלות צלזיוס. לאחר פיתוחה, שיטה זו סללה את הדרך לזיהוי מהיר וקל לביצוע באתר של Bemisia tabaci. הפרוטוקול מתוכנן באופן שבו הוא יכול להתבצע על ידי פקחי בריאות הצמח עם הכשרה מעבדתית מוגבלת.
לאחר אימות מוצלח באתר של השיטה בנקודת כניסה שוויצרית עבור מוצרי ייבוא צמחים, השיטה יכולה להיות מותאמת לפתוגנים צמחיים אחרים, אך גם, במידת הצורך, לפתוגנים אנושיים או וטרינריים אחרים.
Summary
Automatically generated
הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.
Read Article
Cite this Article
Blaser, S., Diem, H., von Felten, A., Gueuning, M., Andreou, M., Boonham, N., Tomlinson, J., Müller, P., Utzinger, J., Frey, B., Frey, J. E., Bühlmann, A. A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci. J. Vis. Exp. (140), e58502, doi:10.3791/58502 (2018).
Copy