Login processing...

JoVE Journal
Medicine

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Medicine

Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen

Ultrasonographic Assessment During Cardiopulmonary Resuscitation

Journal (Medicine)

Ultrasonographic Assessment During Cardiopulmonary Resuscitation

Endoscopy Guided Photoablation of Endometrial Cysts using a 980 nm Laser with a Contact Fiber in Mares

Journal (Medicine)

Endoscopy Guided Photoablation of Endometrial Cysts using a 980 nm Laser with a Contact Fiber in Mares

Click here for the English version

Høy gjennomstrømming Nitrobenzoxadiazole-merket kolesterol middelklasseinnbyggere analysen

Article DOI: 10.3791/58891-v

January 7th, 2019 •

Roque Pastor-Ibáñez¹, Mireia Arnedo¹, Olivia Tort¹

¹Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

January 7th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Måling av i vitro kolesterol middelklasseinnbyggere serum- eller macrophage celle modeller er et lovende verktøy som en biomarkør for aterosklerose. Studien, vi optimalisere og standardisere fluorescerende NBD-kolesterol middelklasseinnbyggere metode og utvikle en høy gjennomstrømming analyse bruker 96-brønns plater.

Transcript

Denne protokollen er vår cellebaserte metode for kolesterolavslutning av kolesterol refluks i ceramal plasma. Spesielt i screeninger. Dette kan brukes til å diagnostisere kardiovaskulær risiko, og for å identifisere eller evaluere kolesterol lavere vedlikehold.

Denne teknikken unngår risiko og byrder som sikkerhet til med håndtering av utstrålte materialer ved å gi resultater med sammenlignbare kvalitetsnivåer, til de av Kolesterol refluks har blitt rapportert å assosiere med Dermed, plasma eller ceramal kolesterol refluks av akseptert kan sammenlignes, til vår referansekontroll og kan gi risiko for å lide av Denne metoden vil også bli brukt på cellelinjene , som andre menneskelige cellelinjer eller til og med primære makrofaser. Makrofaser eller og menneskelige induserte sprayknappstamceller. For å begynne denne prosedyren, oppløs NPD-kolesterolet i rent etanol for å oppnå en lagerløsning med en endelig konsentrasjon av to mikromos.

Fortynn 25 mikroliter av NBD kolesterol lager i AR 10 medium for å nå en endelig konsentrasjon på fem mikromos. Kultur thp-1 celler i våre 10 medium på 37 grader celsius med 5% karbondioksid. Hver tredje dag justerer celletettheten til 300000 celler per milliliter.

Deretter får du en 96-brønns plate med en flat klar bunn. For bedre homogenisering, forberede en 10 milliliter av thp-1 celler i en 15 milliliter rør, og legge til 200 mikroliter pma lager. Bland forsiktig og frø 100 mikroliter av blandingen i platebrønnene ved 200 000 celler per brønn.

Og inkuber ved 37 grader celsius med 5% karbondioksid i 48 til 72 timer for å skille thp-1 cellene i DM thp-1 celler. Fortynn glycin først i 10 % PBS med sterilt vann, til en konsentrasjon på 200 mikromos ved pH 7,4. Tilsett 40 milliliter fortynnet glycin til 10 gram peg 8000 for å forberede en 20% peg løsning, og bland kraftig for å homogenisere.

Deretter påfør fire deler av 20% per 10 deler av prøven til hvert serum eller plasmaprøve i et 1,5 ml rør. La blandingen stå på is i 25 minutter. Sentrifuge pinnen apolipoprotein B utfelt på 13000 ganger G, og ved fire grader celsius i 15 minutter.

Kast bunnstinen, og overfør det overnaturlige til et nytt rør. Hent platen som inneholder de differensierte thp-1-cellene. Fjern og kast kulturmediet, og vask deretter cellene to ganger med 1X PBS.

Tilsett 100 mikroliter med 5 mikromolar MVD-kolesterol i AR-10-medium til hver brønn. Inkuber over natten ved 37 grader celsius med 5%karbondioksid. Neste dag kastes, kast mediet.

Vask cellene to ganger med PBS, og tilsett deretter 100 mikroliter ABDS, eller renset lipid acceptor fortynnet i rpmi 1630 medium til ønsket konsentrasjon til hver brønn. Inkluder en negativ kontroll som ikke inneholder kolesterol akseptorer i en positiv kontroll, som beskrevet i tekstprotokollen, og inkubere ved 37 grader celsius i fire til seks timer. I mellomtiden, forberede en 200 milliliter lager av cellelys løsning en som beskrevet i teksten.

Bland denne løsningen med etanol, med en en-til-en volumetrisk forhold for å oppnå lysis løsning også. For media og BD kolesterol deteksjon, fjern cellemediet fra platene i samlet i en ny hvit 96-brønnsplate med en ugjennomsiktig flat bunn. Tilsett 100 mikroliter ren etanol til 100 mikroliter av hver medium prøve for å oppnå et en-til-en-forhold i den nye platen.

Bruk et illuminometer, mål fluorescerende intensitet ved en eksitasjon på 463 nanometer, og et utslipp på 536 nanometer. For intracellulær NBD kolesterol deteksjon, vask cellene to ganger med PBS. Tilsett 100 mikroliter lysisløsning også til hver brønn, og inkuber ved romtemperatur, mens du rister i 25 minutter.

Etter dette måler du fluorescerende intensitet mens du justerer følsomhetsparameteren til 50 i programvaren. Deretter bestemmer kolesterol efflux rate i det endelige målet av kolesterol efflux som beskrevet i tekstprotokollen. Fortynning av NBD-kolesterol i ren etanol produserer de høyeste fluorescerende intensitetsverdiene, mens et høyt innhold i vandig løsning senker intensiteten.

Dette tyder på at fluorescerende utslipp av dette molekylet er svært avhengig av mediet, der det er inneholdt. Ved bruk av en blanding av media og etanol i et en-til-en-forhold, ser fluorescerende intensitet ut til å øke proporsjonalt, med en konsentrasjon av kolesterolanalogen, noe som tyder på at sonden oppfører seg passende under disse forholdene. For å bestemme hvor lang tid som kreves for å inkubere de lastede cellene med kolesterol acceptorer, høstes cellemedier på forskjellige tidspunkter.

Kolesterol efflux utviklet seg lineært fra null til seks timer, med det maksimale signalet blir fanget seks timer etter ABDS er lagt til cellene. Metningsterskelen og det dynamiske området testes ved å måle kolesterolspluksen ved ulike prosentandeler av HDL som inneholder medier. I den høye gjennomstrømningsressursen utvikler efflux seg lineært fra en til 7% ABDS, og når toppen av kolesterol efflukskapasiteten ved 7%Ved konsentrasjoner høyere enn 7% reduseres fluroescentens intensitet i et omvendt forhold til ABDS-prosentandelen.

Ytelsen til fluorescensbasert metode evalueres deretter ved å sammenligne den med standard radiomerket teknikk. Begge teknikkene er svært korrelert ved bruk av ulike konsentrasjoner av ABDS. Den beskrevne metoden er følsom for en økning av akseptorkonsentrasjoner innenfor kolesterol effluksverdier mellom fem og 15%Det er viktig å sikre at celluarizeren ikke inneholder aggregater.

Kritisk punkt er å vurdere et samlet etanolholdig miljø, for å måle fluorescensen i en homogen og optimal vekt. Etter denne prosedyren kan navn teknisk kolesterol måles, og effekten av legemidler i kolesterol effluksbanen kan bestemmes. Også skolen til slutt bli brukt som en diagnostisk å easer kardiovaskulær risiko.

Vi mener at denne metoden er mye enklere og sikrere enn den radioaktive standardmetoden. Men det er fortsatt celleavhengig. Husk at etanol er brennbart, og det skal lagres og håndteres tilsvarende.

X

Simple Hit Counter