Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En Iodid-gul fluorescerende proteiner-Gap Junction-intercellulær kommunikation Assay
Chapters
Summary February 1st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer her, en protokol for en roman gap junction intercellulær kommunikation assay designet til high throughput screening af gap junction-modulerende kemikalier for drug discovery og toksikologisk vurdering.
Transcript
Gap vejkryds er blevet foreslået som narkotika mål. Iodide-YFP-GJIC-analysen er kompatibel med screening med høj gennemløb for at opdage gap junction-modulatorer. Det har været anvendt til at teste virkningerne af et stort antal forbindelser på gap junction aktiviteter i en relativt kort periode.
Iodide-YFP-GJIC assay er enkel, robust, repeterbar og billig. Denne analyse kræver kun acceptor og donorceller og to afbalancerede saltopløsninger. Ingen yderligere reagenser såsom Lucifer gul og Calcein AM er nødvendige.
Også det måler samlede hul junction aktiviteter af cellerne i en enkelt brønd, hvilket resulterer i lav mellem-godt variation. For at starte denne procedure vokse LN215 celler til 80%sammenløb i suppleret DMEM som skitseret i tekstprotokollen. En dag før transduktion vaskes cellerne to gange med 10 milliliter PBS.
Tilføj to milliliter 0,25% trypsin EDTA til cellerne og inkubere ved 37 grader Celsius i tre minutter. Ved hjælp af en 10-milliliter serologisk pipette resuspenderede cellerne i fem milliliter kultur medium og justere celletæthed til 50, 000 celler pr milliliter. Tilføj 400 mikroliter af medier, som indeholder 20.000 celler til hver brønd af en 24-brønd kultur plade.
Inkubere ved 37 grader Celsius i 24 timer. Den næste dag transduce to brønde ved at erstatte kultur medium med 400 mikroliter af en en-til-en blanding af en lentivirus og frisk kultur medium suppleret med polybren ved en endelig koncentration af fire mikrogram per milliliter. For ingen virus kontrol erstatte kultur medium med frisk kultur medium suppleret med polybren ved en endelig koncentration af fire mikrogram pr milliliter.
Inkubere ved 37 grader Celsius i 15 timer. Derefter aspirere mediet indeholder lentivirus, og frisk kultur medium. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i yderligere 72 timer.
Herefter vaskes cellerne i hver brønd to gange med 0,5 milliliter PBS. Tilføj 300 mikroliter på 0,25% trypsin EDTA til cellerne, og inkubere ved 37 grader Celsius i tre minutter. Resuspend cellerne i to milliliter kultur medium, og derefter plade dem i seks-brønd kultur plader med to mikrogram pr milliliter puromycin.
Dyrs cellerne, indtil alle cellerne i kontrolsystemerne er døde, hvilket normalt tager cirka en uge. For det første, separat kultur LN215-YFP og LN215-iodid celler i 100-millimeter plader i kultur medium for at nå de populationer, der kræves for analysen. En dag før analysen vaskes hver plade med 10 milliliter PBS.
Behandl hver plade med to milliliter 0,25% trypsin EDTA opløsning, og inkuberes ved 37 grader Celsius i fem minutter. Cellerne opsaltes i fire milliliter kulturmedium og overfører dem til 15 milliliter koniske rør. Centrifuge ved 1,000 g i tre minutter for at pellet cellerne.
Kassér supernatanten og opsplit hver cellepille i fem milliliter kulturmedium. Pipette op og ned omkring 20 gange for at bryde op nogen celle klumper. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne.
Og derefter fortynde cellerne i kultur medium til at gøre celle suspension på tætheder vist her. Dernæst blandes syv milliliter af hver celle suspension sammen i et reservoir. Brug en multikanalpipette til at tilføje 100 mikroliter af denne blanding til hver brønd af en 96-brønds kulturplade.
Inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 24 timer. Først skal du bruge et fluorescensmikroskop med 20X forstørrelse og et GFP-filter for at kontrollere 96-brøndpladerne for at sikre, at der ikke er klumper af celler, og at kulturerne er fuldt sammenflydende og godt fordelt. Mindst 30 minutter før analysen tænde en mikroplade læser og sæt den til 37 grader Celsius.
En automatiseret injektor vaskes med tre milliliter 70 %ethanol, tre milliliter destilleret vand og tre milliliter I-opløsning. Dernæst varme C og I-løsninger til 37 grader Celsius i et vandbad. Enten aspirere vækstmediet eller inverter pladen for at tømme den.
Tryk ud eventuelle resterende medium. Derefter tilsættes C-opløsningen til et reservoir ved hjælp af en multikanalpipette for at tilføje 200 mikroliter C-opløsning til hver brønd af pladen. Enten aspirere opløsningen eller vende pladen for at tømme den, hvilket gør at udnytte eventuelle resterende opløsning.
Tilføj 50 mikroliter C-opløsning til hver brønd. Derefter tilsættes en mikroliter af enten en 2,5-millimolar kemiske lager eller DMSO som et køretøj, og tilsæt yderligere 50 mikroliter af C-opløsning til hver brønd. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i luften i ca. 10 minutter.
Under inkubationen skal du begynde at angive parametrene i mikropladelæserprogrammet ved at klikke på knappen Administrer protokoller. Klik på knappen Ny. Vælg Fluorescensintensiteten i afsnittet Målemetode og Brøndtilstand i afsnittet Læsetilstand.
Klik derefter på knappen OK. Der vises en ny fane. I menuen Grundlæggende parametre indstilles Excitation wavelength til 485 nanometer og emissionen til 520 nanometer.
Vælg den nederste optik for at læse fluorescens fra bunden. Indstil derefter målestarttiden til nul sekunder, antallet af intervaller til at være 25, antallet af blink pr. brønd og interval til at være 20, og intervaltiden er 0,4 sekunder. Tegn et område af pladen, der skal læses, i menuen Layout.
I menuen Koncentrationer/mængder/Shacking indstilles mikropladelæseren til at injicere 100 mikroliter I-opløsning til hver brønd med en injektionshastighed på 135 mikroliter pr. sekund. I menuen Injektionstid indstilles injektionsstarttiden til at være et sekund. Klik derefter på knappen Start måling.
Når inkubationen er færdig, skal du overføre 96-brøndspladerne til mikropladelæseren og starte målingen ved at klikke på knappen Start måling igen. I denne undersøgelse, jod-gul fluorescerende protein-gap junction-intercellulære kommunikation assay anvendes med LN215-YFP og LN215-jod celler til at screene 2, 320 kemikalier til at identificere nye hul junction intracellulære kommunikation modulatorer. Homosalt ses at hæmme 50% af gap junction intracellulær kommunikation.
Mens terbinafine helt hæmmer det. Dette bekræfter terbinafine som et hul junction hæmmer. Denne analyse måler GJIC mellem tilstødende donor og acceptorceller, så donor- og acceptorcellerne skal være fuldstændig adskilt før plettering.
Og sammenløbet af den blandede kultur bør være 100% for at maksimere dannelsen af kløft vejkryds mellem celler. Tidsforløbsdata, dosisresponsrelationer og vurdering af reversibiliteten af gap junction-modulatorer kan opnås med Iodide-YFP-GJIC-analysen. Også, Iodide-YFP specifikke connexin GJIC assays kan etableres ved at fremkalde udtryk for en connexin af interesse i cellerne blottet for funktionelle hul vejkryds.
Dette gør det muligt at bestemme IC50-værdien af et kemikalie af en bestemt type forbindelse. Iodide-YFP-GJIC assay kan bruges til høj-throughput screening, fordi det er robust, repeterbar, og billig. Denne analyse hjælper med at finde hul krydset modulerende kemikalier til narkotika opdagelse og toksikologisk vurdering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
