Biology
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一种碘-黄色荧光荧光蛋白-缝隙--细胞间通信方法
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Summary February 1st, 2019
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在这里, 我们提出了一种新的缝隙结细胞间通信检测的协议, 旨在为药物发现和毒理学评估的间隙结调节化学品的高通量筛选。
Transcript
差距交界处已被建议为药物目标。碘化物-YFP-GJIC测定与高通量筛选兼容，可发现间隙结调制剂。它被用来在相对较短的时期内测试大量化合物对间隙结活动的影响。
碘化物-YFP-GJIC测定简单、坚固、可重复且价格低廉。这种测定只需要接受方和供体细胞和两个平衡的盐溶液。无需其他试剂，如路西法黄色和钙素 AM。
它还测量单个井中细胞的总间隙结活动，从而导致井间变异性低。为了开始此过程，如文本协议中所述，在补充的 DMEM 中将 LN215 细胞增长到 80% 的汇合。转导前一天用10毫升PBS清洗细胞两次。
在细胞中加入两毫升0.25%的三丁辛EDTA，并在37摄氏度下孵育3分钟。使用10毫升血清移液器将细胞重新在培养培养的5毫升中重新暂停，并调整细胞密度为每毫升5万个细胞。在24井培养板的每个井中加入400个微升的介质，其中含有2万个细胞。
在37摄氏度下孵育24小时。第二天，用400微升的一对一的扁病毒混合物和新鲜培养基的混合物以每毫升4微克的最终浓度换代两口水，从而将两口水转印两口。对于无病毒控制取代培养基与新鲜培养基辅以多布雷恩，最终浓度为每毫升4微克。
在37摄氏度下孵育15小时。然后吸出含有扁病毒的媒介和新鲜培养基。在37摄氏度下孵育细胞，再多孵育72小时。
在此之后，用0.5毫升的PBS洗涤每个井中的细胞两次。在细胞中加入300微升0.25%的三辛EDTA，并在37摄氏度下孵育3分钟。将细胞重新用两毫升培养基，然后用每毫升紫霉素两微克的六孔培养板进行镀。
培养细胞，直到控制井中的所有细胞都死，这通常需要大约一个星期。首先，在培养介质中100毫米板中分别培养LN215-YFP和LN215-碘化物细胞，以达到测定所需的人群。在测定前一天，用10毫升的PBS清洗每个盘子。
用两毫升0.25%的尝试性EDTA溶液治疗每个板，并在37摄氏度下孵育5分钟。将细胞重新用四毫升培养培养物中重新发送，并转移到15毫升的锥形管中。在1000克下离心3分钟，对细胞进行分粒。
丢弃上一提液，将每个细胞颗粒重新在五毫升培养培养中。上下移液约20次，以分解任何细胞团。使用血细胞计计算细胞数。
然后稀释培养基中的细胞，使细胞悬浮在此处所示的密度。接下来，将每个细胞悬浮液的七毫升混合在一起。在储液罐中。使用多通道移液器将这种混合物的100微升添加到96井培养板的每个井中。
在37摄氏度下孵育，24小时用5%的二氧化碳孵育。首先，使用具有 20 倍放大倍率的荧光显微镜和 GFP 过滤器检查 96 孔板，以确保没有细胞团块，并且培养物是完全汇合和良好分布的。检测打开微孔板读取器并设置为 37 摄氏度之前至少 30 分钟。
用三毫升 70%乙醇、三毫升蒸馏水和三毫升 I 溶液清洗自动喷油器的管子。接下来，在水浴中将 C 和 I 溶液加热到 37 摄氏度。要么吸气生长介质，要么倒置板来清空。
点击任何残留介质。然后使用多通道移液器将 C 溶液添加到储液罐中，在板的每个井中添加 200 微升的 C 溶液。吸气溶液或倒置板以清空，以找出任何残留溶液。
在每个井中加入50微升的C溶液。然后添加一个2.5毫摩尔化学库存或DMSO作为工具的微升，并在每井中再添加50微升的C溶液。在37摄氏度的空气中孵育细胞约10分钟。
在孵化过程中，通过单击"管理协议"按钮，开始在微孔板读取器程序中设置参数。单击"新"按钮。选择"测量方法"部分中的荧光强度和"阅读模式"部分中的"井模"。
接下来，单击"确定"按钮。将出现一个新选项卡。在"基本参数"菜单中，兴奋波长设置为 485 纳米，将发射设置为 520 纳米。
选择底部光学元件从底部读取荧光。然后将测量开始时间设置为零秒，间隔数设置为 25，每井闪烁数和间隔数设置为 20，间隔时间设置为 0.4 秒。在"布局"菜单中绘制要读取的板区域。
在浓度/体积/棚屋菜单中，微孔板读卡器以135微升/秒的喷射速度将100微升的 I-solution 注入到每孔。在"喷射时间"菜单中，喷射开始时间设置为一秒。然后单击"开始"测量按钮。
孵育完成后，将 96 孔板转移到微孔板读卡器，然后再次单击"开始"测量按钮开始测量。本研究采用碘-黄荧光蛋白-间隙结-细胞间通信测定法与LN215-YFP和LN215-碘细胞一起筛选2，320种化学物质，以识别新型间隙结间细胞间通信调节器。同酸酯被认为抑制50%的间隙结细胞内通信。
而特比纳芬完全抑制它。这证实了三叶草作为间隙结抑制剂。此测定测量相邻供体和接受细胞之间的GJIC，因此在电镀前，供体和接受细胞必须完全分离。
混合培养的汇合应100%，以最大限度地形成细胞之间的间隙结。通过碘化-YFP-GJIC测定，可以获取时间过程数据、剂量响应关系和评估间隙结调制剂的可逆性。此外，碘化物-YFP特异性康尼辛GJIC测定可以通过诱导感兴趣的康尼辛的表达进入没有功能间隙结的细胞来建立。
这使得可以确定特定类型康尼辛的化学品的 IC50 值。碘化物-YFP-GJIC测定可用于高通量筛选，因为它坚固、可重复且价格低廉。这种测定有助于找到用于药物发现和毒理学评估的调节化学品的间隙结。
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