Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Иодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи Assay
Chapters
Summary February 1st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь мы представляем протокол для Роман разрыв соединения межклеточные связи assay предназначен для высокопроизводительного скрининга разрыв соединения модулирующих химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологические оценки.
Transcript
Gap соединения были предложены в качестве целей наркотиков. Анализ Iodide-YFP-GJIC совместим с высокой пропускной способностью скрининга, чтобы обнаружить разрыв соединения модуляторов. Он используется для проверки воздействия большого числа соединений на деятельность соединения зазоров в относительно короткий период времени.
Анализ Iodide-YFP-GJIC прост, надежн, повторяем и недорог. Для этого анализа требуются только донорские и донорские клетки и два сбалансированных солевых раствора. Никаких дополнительных реагентов, таких как Люцифер желтый и Calcein AM не требуется.
Кроме того, он измеряет общий разрыв соединения деятельности клеток в одной хорошо, что приводит к низкой между хорошо изменчивости. Для начала этой процедуры вырастет LN215 ячеек до 80% стечения в дополненной DMEM, как указано в текстовом протоколе. За день до трансдукции мыть клетки дважды с 10 миллилитров PBS.
Добавить два миллилитров 0,25%трипсина EDTA в клетки и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. С помощью 10-миллилитрового серологического пипетки повторно помесят клетки в пять миллилитров среды культуры и отрегулируйте плотность клеток до 50 000 клеток на миллилитр. Добавьте 400 микролитров мультимедиа, которые содержат 20 000 ячеек к каждому колодец 24-колодец культуры пластины.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день вывести две скважины, заменив культурную среду 400 микролитров смеси лентивируса и свежей культуры, дополненной полибреном при конечной концентрации в четыре микрограмма на миллилитр. Ибо отсутствие контроля над вирусом заменяет культурную среду свежей культурной средой, дополненной полибреном при конечной концентрации в четыре микрограмма на миллилитр.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 часов. Затем аспирировать среды, содержащие лентивирусы, и свежие среды культуры. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение еще 72 часов.
После этого, мыть клетки в каждом хорошо в два раза с 0,5 миллилитров PBS. Добавить 300 микролитров 0,25%трипсина EDTA в клетки, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Повторное течение клеток в двух миллилитров культуры среды, а затем пластины их в шесть хорошо культуры пластин с двумя микрограммами на миллилитр пуромицина.
Культура клетки, пока все клетки в контрольных скважин мертвы, что обычно занимает около недели. Во-первых, отдельно культуры LN215-YFP и LN215-йодидных клеток в 100-миллиметровых пластин в среде культуры для достижения населения, необходимого для анализа. За день до анализа, мыть каждую тарелку с 10 миллилитров PBS.
Лечить каждую тарелку с двумя миллилитров 0,25%трипсина EDTA раствор, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Повторное использование клеток в четырех миллилитров среды культуры и передать их в 15-миллилитровых конических труб. Центрифуга при 1000 г в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки.
Откажитесь от супернатанта и повторно посовещение каждой клеточной гранулы в пять миллилитров среды культуры. Pipette вверх и вниз около 20 раз, чтобы разбить любые ячейки сгустки. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.
А затем разбавить клетки в среде культуры, чтобы сделать подвес клеток на плотности показано здесь. Затем смешайте семь миллилитров каждой клеточной подвески вместе в резервуаре. Используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 100 микролитров этой смеси к каждому колодец 96-ну культуры пластины.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 24 часов. Во-первых, используйте флуоресцентный микроскоп с увеличением 20X и фильтр GFP, чтобы проверить 96-хорошо пластин, чтобы убедиться, что Есть нет скопления клеток, и что культуры полностью confluent и хорошо распределены. По крайней мере за 30 минут до анализа включите микроплюрат и установите его до 37 градусов по Цельсию.
Вымойте трубки автоматизированного инжектора с тремя миллилитров 70% этанола, три миллилитров дистиллированной воды, и три миллилитров I-решения. Далее, тепло C и I-решений до 37 градусов по Цельсию в водяной бане. Либо аспирировать рост среды или инвертировать пластины, чтобы очистить его.
Нажмите на любую остаточную среду. Затем добавьте C-решение в резервуар с помощью многоканальной пипетки, чтобы добавить 200 микролитров C-решения к каждой пластине. Либо аспирировать раствор или инвертировать пластину, чтобы очистить его, что делает выстучать любой остаточный раствор.
Добавьте 50 микролитров C-решения к каждой колодец. Затем добавьте один микролитр либо 2,5-миллимолярный химический запас или DMSO в качестве транспортного средства, и добавьте еще 50 микролитров C-решения к каждой колодец. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в воздухе в течение примерно 10 минут.
Во время инкубации начните устанавливать параметры в программе чтения микроплатформ, нажав кнопку Протоколы управления. Нажмите на новую кнопку. Выберите интенсивность флуоресценции в разделе Метод измерения и режим Well Mode в разделе Режим чтения.
Далее нажмите кнопку OK. Появится новая вкладка. В меню «Основные параметры» длина волны Возбуждения составляет 485 нанометров, а эмиссия — до 520 нанометров.
Выберите нижнюю оптику для чтения флуоресценции снизу. Затем установите время начала измерения на ноль секунд, количество интервалов будет 25, количество вспышек на колодец и интервал будет 20, а интервал времени будет 0,4 секунды. В меню Layout нарисуйте область пластины для чтения.
В меню Концентрации/Объемы/Shacking установлен считыватель микропластиров для впрыскивания 100 микролитров I-решения к каждому хорошо со скоростью впрыска 135 микролитров в секунду. В меню Время инъекций установите время начала инъекции на одну секунду. Затем нажмите кнопку «Начало измерения».
Когда инкубация завершена, перенесите пластины 96-колодец на считыватель микропластиц и начните измерение, нажав кнопку измерения Пуск снова. В этом исследовании, йод-желтый флуоресцентный белок-пробел соединения межклеточной связи анализ используется с LN215-YFP и LN215-йодных клеток для экрана 2, 320 химических веществ для выявления новых разрывов внутриклеточных модуляторов связи. Homosalate, как видно, подавляет 50% разрыва внутриклеточной связи.
В то время как тербинафин полностью подавляет его. Это подтверждает тербинафин в качестве ингибитора разрыва соединения. Этот анализ измеряет GJIC между соседними донорами и клетками-приемокторами, поэтому донорские и приемочные клетки должны быть полностью разобщены перед покрытием.
И слияние смешанной культуры должно быть 100%, чтобы максимизировать образование разрывов между клетками. Данные о курсах времени, отношения реакции дозы и оценка обратимости модуляторов соединения разрыва могут быть получены с помощью анализа Iodide-YFP-GJIC. Кроме того, Iodide-YFP конкретных connexin GJIC анализы могут быть созданы путем индуцирования выражения коннексина интереса в ячейки, лишенные функциональных соединений разрыв.
Это позволяет определить значение IC50 химического вещества определенного типа коннексина. Анализ Iodide-YFP-GJIC может быть использован для скрининга с высокой пропускной способностью, поскольку он является надежным, повторяемым и недорогим. Этот анализ помогает найти разрыв соединения модуляции химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологической оценки.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
