Biology
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An आयोडाइड-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन गैप जंक्शन-सेलुलर संचार परख
Chapters
Summary February 1st, 2019
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यहां, हम अंतर जंक्शन के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए डिजाइन एक उपंयास अंतर जंक्शन सेलुलर संचार परख के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-दवा की खोज और विषाक्तता आकलन के लिए रसायन संग्राहक ।
Transcript
गैप जंक्शनों को ड्रग टारगेट के तौर पर सुझाया गया है । आयोडाइड-वाईएफपी-जीजीईसी परख गैप जंक्शन मोडुलेटर्स की खोज करने के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के साथ संगत है। इसका उपयोग अपेक्षाकृत कम अवधि में गैप जंक्शन गतिविधियों पर बड़ी संख्या में यौगिकों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया गया है।
आयोडाइड-वाईएफपी-जीजीईसी परख सरल, मजबूत, दोहराने योग्य और सस्ती है। इस परख केवल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं और दो संतुलित नमक समाधान की आवश्यकता है । लूसिफ़ेर येलो और कैल्सेइन एएम जैसे किसी अतिरिक्त अभिकर्ण की आवश्यकता नहीं है।
इसके अलावा यह कोशिकाओं की कुल गैप जंक्शन गतिविधियों को एक ही कुएं में मापता है जिसके परिणामस्वरूप कम बीच-अच्छी परिवर्तनशीलता होती है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित पूरक डीएमईएम में एलएन215 कोशिकाओं को 80% तक बढ़ाया जाए। एक दिन पहले ट्रांसडक्शन पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोते हैं।
कोशिकाओं में 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए के दो मिलीलीटर जोड़ें और तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम के पांच मिलीलीटर में फिर से खर्च करें और सेल घनत्व को 50, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर में समायोजित करें। मीडिया के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें 24-अच्छी संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में 20, 000 कोशिकाएं शामिल हैं।
24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। अगले दिन संस्कृति माध्यम को एक लेंटीवायरस और ताजा संस्कृति माध्यम के ४०० माइक्रोलीटर के साथ बदलकर चार माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर पॉलीब्रेन के साथ पूरक किया जाता है । कोई वायरस नियंत्रण के लिए ताजा संस्कृति माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह चार माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर पॉलीब्रेन के साथ पूरक ।
15 घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फिर लेंटीवायरस युक्त माध्यम और ताजा संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करें। कोशिकाओं को अतिरिक्त 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
इसके बाद, पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर के साथ दो बार प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को धोएं। कोशिकाओं में 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, और तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम के दो मिलीलीटर में फिर से खर्च करें, और फिर उन्हें छह-अच्छी संस्कृति प्लेटों में दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर प्यूरोमाइसिन के साथ प्लेट करें।
संस्कृति कोशिकाओं जब तक नियंत्रण कुओं में कोशिकाओं के सभी मर चुके हैं, जो आम तौर पर लगभग एक सप्ताह लगते हैं । सबसे पहले, संस्कृति माध्यम में १०० मिलीमीटर प्लेटों में अलग से संस्कृति LN215-YFP और LN215-iodide कोशिकाओं को परख के लिए आवश्यक आबादी तक पहुंचने के लिए । परख से एक दिन पहले, पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक प्लेट धोएं।
0.25% ट्राइप्सिन EDTA समाधान के दो मिलीलीटर के साथ प्रत्येक प्लेट का इलाज करें, और पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम के चार मिलीलीटर में फिर से खर्च करें और उन्हें 15 मिलीलीटर शंकुभाषी ट्यूबों में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को गोली मारने के लिए तीन मिनट के लिए 1, 000 ग्राम पर सेंट्रलाइज।
सुपरनेट को त्यागें और प्रत्येक सेल पेलेट को संस्कृति माध्यम के पांच मिलीलीटर में फिर से रीसस्ट करें। किसी भी सेल झुरमुट को तोड़ने के लिए लगभग 20 बार पिपेट ऊपर और नीचे। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
और फिर संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को पतला करने के लिए यहां दिखाया घनत्व पर सेल निलंबन करते हैं । इसके बाद, एक जलाशय में प्रत्येक कोशिका निलंबन के सात मिलीलीटर को एक साथ मिलाएं। 96-अच्छी संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। सबसे पहले, 20X आवर्धन और एक GFP फिल्टर के साथ एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए ९६ अच्छी तरह से प्लेटों की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां कोशिकाओं के कोई झुरमुट हैं, और है कि संस्कृतियों को पूरी तरह से संकुचित और अच्छी तरह से वितरित कर रहे हैं । परख से कम से कम 30 मिनट पहले एक माइक्रोप्लेट रीडर चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
70% इथेनॉल के तीन मिलीलीटर, तीन मिलीलीटर आसुत पानी, और आई-सॉल्यूशन के तीन मिलीलीटर के साथ एक स्वचालित इंजेक्टर की ट्यूबिंग धोएं। इसके बाद, सी और आई-सॉल्यूशंस को पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। या तो विकास माध्यम को आकांक्षी करें या फिर प्लेट को खाली करने के लिए उलटा करें।
किसी भी अवशिष्ट माध्यम को टैप करें। फिर प्लेट के प्रत्येक कुएं में सी-सॉल्यूशन के 200 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके जलाशय में सी-सॉल्यूशन जोड़ें। या तो समाधान को एस्पिरेट करें या प्लेट को खाली करने के लिए उलटा करें, जिससे किसी भी अवशिष्ट समाधान को टैप किया जा सके।
प्रत्येक कुएं में सी-सॉल्यूशन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर एक वाहन के रूप में या तो 2.5-मिलीमोलर रासायनिक स्टॉक या डीएमएसओ का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्रत्येक कुएं में सी-समाधान के एक और 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। लगभग 10 मिनट के लिए हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के दौरान, मैनेज प्रोटोकॉल बटन पर क्लिक करके माइक्रोप्लेट रीडर प्रोग्राम में पैरामीटर सेट करना शुरू करें। नए बटन पर क्लिक करें। मापन विधि अनुभाग में फ्लोरेसेंस तीव्रता का चयन करें, और पढ़ने मोड अनुभाग में अच्छी तरह से मोड।
इसके बाद ओके बटन पर क्लिक करें। एक नया टैब दिखाई देगा। बुनियादी मापदंडों मेनू में 485 नैनोमीटर के लिए उत्साह तरंगदैर्ध्य सेट, और 520 नैनोमीटर के लिए उत्सर्जन।
नीचे से फ्लोरेसेंस पढ़ने के लिए बॉटम ऑप्टिक का चयन करें। फिर माप शुरू समय शून्य सेकंड होने के लिए सेट करें, अंतराल की संख्या 25 हो, प्रति अच्छी तरह से चमक की संख्या और अंतराल 20 होना चाहिए, और अंतराल समय 0.4 सेकंड होना चाहिए। लेआउट मेनू में पढ़ने के लिए प्लेट का एक क्षेत्र आकर्षित करता है।
सांद्रता/वॉल्यूम/शेकिंग मेनू में माइक्रोप्लेट रीडर को १३५ माइक्रोलीटर प्रति सेकंड के इंजेक्शन की गति के साथ प्रत्येक कुएं के लिए आई-सॉल्यूशन के १०० माइक्रोलीटर इंजेक्ट करने के लिए सेट किया गया है । इंजेक्शन समय मेनू में इंजेक्शन शुरू समय सेट करने के लिए एक दूसरे हो । इसके बाद स्टार्ट मेजरमेंट बटन पर क्लिक करें।
इनक्यूबेशन पूरा होने पर 96-वेल प्लेट्स को माइक्रोप्लेट रीडर में ट्रांसफर करें और स्टार्ट मेजरमेंट बटन पर फिर से क्लिक करके मेजरमेंट शुरू करें। इस अध्ययन में, आयोडीन-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन-गैप जंक्शन-इंटरसेलुलर संचार परख का उपयोग एलएन215-वाईएफपी और एलएन215-आयोडीन कोशिकाओं के साथ उपन्यास गैप जंक्शन इंट्रासेलुलर कम्युनिकेशन मॉड्यूलर की पहचान करने के लिए 2, 320 रसायनों को स्क्रीन करने के लिए किया जाता है। होमोसेलेट को गैप जंक्शन इंट्रासेलुलर संचार के 50% को बाधित करने के लिए देखा जाता है।
जबकि टेरबिनाफिन इसे पूरी तरह से रोकता है। यह एक गैप जंक्शन अवरोधक के रूप में terbinafine की पुष्टि करता है । यह परख पड़ोसी दाता और स्वीकारकर्ता कोशिकाओं के बीच GJIC उपाय है, तो दाता और स्वीकारकर्ता कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले पूरी तरह से अलग किया जाना चाहिए ।
और मिश्रित संस्कृति का संगम कोशिकाओं के बीच गैप जंक्शनों के गठन को अधिकतम करने के लिए १००% होना चाहिए । टाइम कोर्स डेटा, खुराक प्रतिक्रिया संबंध, और गैप जंक्शन मोडुलेटर की रिवर्सिबिलिटी का आकलन आयोडाइड-वाईएफपी-जीजीईसी परख के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, आयोडाइड-वाईएफपी विशिष्ट कॉननेक्सिन जीजीईसी का अर्थ कार्यात्मक गैप जंक्शनों से रहित कोशिकाओं में ब्याज की एक connexin की अभिव्यक्ति को प्रेरित करके स्थापित किया जा सकता है।
यह एक विशिष्ट प्रकार के कॉन्क्सिन के रसायन के IC50 मूल्य का निर्धारण करना संभव बनाता है। आयोडाइड-वाईएफपी-जीजीईसी परख का उपयोग उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है, क्योंकि यह मजबूत, दोहराने योग्य और सस्ती है। यह परख दवा की खोज और विष विज्ञान के आकलन के लिए गैप जंक्शन मॉड्यूलिंग रसायनों को खोजने में मदद करता है ।
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