Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En tripeptid-stabiliserad Nanoemulsion oljesyra
Chapters
Summary February 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Det här protokollet beskriver en effektiv metod för att syntetisera en nanoemulsion av en oljesyra acids-platinum(II) konjugat stabiliserad med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptid. De nanoemulsion formerna under milda syntetiska förhållanden via självmontering av KYF och konjugat.
Transcript
Med tanke på det breda utbudet av korta peptidsekvenser kan denna metod utvidgas till många andra nanopartikelkonstruktioner. Peptidmodifiering kan göra systemet lämpligt för diagnostiska ändamål. Inkapsling anti-cancer platina till läkemedel med biologiskt nedbrytbara, låg toxicitet stabiliserande medel är mycket relevant för farmaceutiska tillämpningar.
Preliminära in-vivo studier med äggstockscancer är lovande och kommer att undersökas ytterligare. Till att börja med, suspendera 50 milligram cisplatin i fyra milliliter ultrarent vatten vid 60 grader Celsius. Tillsätt silvernitratlösningen droppvis till cisplatinlösningen och rör blandningen vid 300 till 400 RPM i två timmar vid 60 grader Celsius i mörker.
Därefter använder 10%by weight saltsyra för att bekräfta att det inte finns några fria silverjoner i lösning. Om ingen ytterligare silverklorid bildas vid tillsats av saltsyra, centrifug blandningen vid 3, 220 gånger gravitationen i 10 minuter. Dekantera supernatanten och filtrera den genom ett 0,2 mikrometersprutfilter.
Testa sedan filtratet för platina genom att applicera två till tre droppar till 10 två kloridkristaller. Platina finns om fjädringen blir mörkbrun eller orange. Tillsätt därefter 13,3 milligram natriumhydroxid i en milliliter vatten i 94,2 milligram suspension av oljesyra i tre milliliter vatten vid 60 grader Celsius.
Rör om blandningen i två timmar vid 60 grader Celsius. Stäng sedan av värmen och fortsätt röra om i rumstemperatur i 16 till 24 timmar för att få råvaran som en oljig, gulbrun fällning. Centrifugera reaktionsblandningen vid 3, 220 gånger gravitation i 10 minuter, och ta bort supernatanten.
Torka produkterna på en roterande förångare vid 25 grader Celsius. Suspendera råvaran i fem milliliter acetonitril genom att virvelst och återvinna produkten genom centrifugering. Upprepa denna tvättprocess minst två tre gånger till för att få fram den rena, oljesyra platina II konjugat som en blekgul fast ämne.
Först, blöt 5,7 gram Fmoc skyddade L-fenylalanin funktionaliserade Wang harts i 25 milliliter dimetylformamid i en timme. Sedan, blöt harts i 15 milliliter av 20%piperidin i DMF i fem minuter medan skakar vid 80 RPM för att de-skydda amin. Töm hartset och upprepa avskyddet i 20 minuter.
Tvätta hartset med DMF och isopropylalkohol efteråt. När de-skydd har bekräftats, tillsätt Fmoc skyddad L-tyrosin TBTU och DIPEA och agitera blandningen i 16 till 24 timmar för att utföra koppling. Tvätta harts med DMF och isopropylalkohol.
Utför Kaiser test och fortsätt med avskydd och tvätta som tidigare beskrivits. Par och de-skydda Fmoc skyddas lysin på samma sätt. Tvätta hartset med DMF, IPA, metanol, diklormetan, och diethyleter efteråt.
Avsätt ett gram KYF-bärande harts för FITC-modifiering. Blötlägg resterande harts i 95%trifluorättiksyra. 2,5%triisopropylsilan och 2,5%vatten i tre timmar för att klyva tripeptiden från hartset.
Fäll ut råpeptid med diethyleter kyls till 20 grader Celsius. Tvätta fällningen tre gånger genom centrifugeringen i 30 till 40 milliliter portioner kallsytyleter och torka den under vakuum. Därefter blanda resterande gram KYF harts med 120,1 milligram 6-acetohexanoic syra i 30 milliliter DMF med TBTU och DIPEA.
Agitera blandningen i 16 till 24 timmar i rumstemperatur för att erhålla den azid modifierade tripeptiden. Sedan, kombinera 253 milligram av denna harts med 3.78 milligram fast koppar(I)iodide 71.9 milligram propargyl florisean och 2.24 milligram DIPEA. Låt blandningen reagera medan du skakar i 24 timmar.
Därefter, tvätta noggrant FITC-modifierade KYF-lagerharts. Klyva FITC-modifierade KYF från hartset och rena det på samma sätt som den omodifierade tripeptiden. För att börja förbereda nanoemoulsion, lösa upp 10 milligram av oljesyra platina II konjugat i 1,5 milliliter av IPA.
Dra denna lösning i en 5 milliliter spruta, fäst en 20 gauge nål, och montera sprutan på en spruta pump över reaktionsområdet. Ställ in sprutpumpen på 0,1 milliliter per minut. För en nanoemulsion med FITC modifierad KYF, lös ett milligram FITC modifierat KYF och ett milligram omodifierad KYF i 20 milliliter vatten.
För en nanoemulsion med omodifierad KYF, istället lösa två milligram KYF i 20 milliliter vatten. Värm den FITC-modifierade eller omodifierade KYF-lösningen till 37 grader Celsius. Säkerställ att KYF-lösningen rör om vid ca 400 RPM, och att sprutan är i linje med lösningen.
Starta sedan sprutpumpen för att börja lägga till oljesyra platina två konjugat droppe klokt. När konjutten har tillsatts, minska omrörningshastigheten till 150 RPM och låt lösningen svalna till rumstemperatur. Fortsätt röra om i 16 till 24 timmar.
Koncentrera sedan nanoemultionen i en 10 000 Daltons centrifugalfilterenhet. Tvätta nanoemulsionen i en centrifugalfilterenhet tre gånger med fyra milliliter portioner ultrarent vatten. Och sedan lagra det som en vattenlösning vid fyra grader Celsius.
Slutprodukten är opaliserande för KYF-nanopartiklar och fluorescerande för FITC-modifierade nanopartiklar. Dropparna i en nanoemulsion beredd med omodifierade KYF var sfäriska, väl spridda, och relativt enhetlig i storlek. Baserat på transmissionselektronmikroskopibilder var kärnorna cirka 107 nanometer i diameter.
Fitc-modifierad nanoemulsion, som visas här i grönt, kan komma in celler från olika äggstockscancer cellinjer. Medan den hydrodynamiska diametern på båda formuleringarna ökade under fyra månaders lagring i vatten, bevarades de övergripande dimensionerna. Dessutom observerades ingen opsonization av emulsion efter en dag av inkubation i 20%fetala nötkreatur serum.
Frisättningen av platina från emulsionen var långsammast vid pH 7,4 med endast 20,8%av platinan som släpptes efter fyra timmar. Platinarelease accelererade när pH-värdet minskade. Den platina-innehållande KYF belagda nanoemulsion minskade livskraften hos dessa äggstockscancer cellinjer i mycket högre grad än vad som uppnåddes av carboplatin, den kliniskt relevanta analog.
Nanoemulsionen visade också en jämförbar eller större minskning av lönsamheten än cisplatin i fem av de sex cellinjerna. Den KYF-belagda nanoemulsionen framkallade konsekvent en jämförbar eller större minskning av lönsamheten än konjugaten för oljesyra i platina II ensamt. Detta är en enkel, effektiv metod för att kapsla in hydrofoba therapeutics inom tripeptid bas nanopartikel ställningen.
Korta peptider är biologiskt nedbrytbara, och har låg toxicitet, vilket är betydande för medicin och bioteknik. Utför denna procedur under draghuven för att undvika exponering för organiska lösningsmedel. Platinaolsyra och KYF platina nanoemulsioner har anti-cancer egenskaper och därför bör hanteras med särskild omsorg.
Denna metod är enkel när det gäller låg filabilator aktivitet och utrustning, men det bygger på korrekt tillämpning av syntesstrategi, och underliggande kemiska begrepp. Vår metod kan utökas för att leverera andra små läkemedelsmolekyler. Nanopartikelkärnan består av oljesyra och är därför lämplig för inkapsling av hydrofoba medel.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.