Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Denne protokollen tillater oss å enkelt utforske de epigenetiske egenskapene til nevrodegenerativ sykdom. Den største fordelen med denne teknikken er at den utnytter gjær som et modellsystem, sammenlignet med andre cellulære og animalske modeller av nevrodegenerativ sykdom, gjær er hensiktsmessig og kostnadseffektiv. Denne teknikken tillater oss å kartlegge de epigenetiske endringene som oppstår i nevrodegenerativ sykdom, noe som kan føre til nye markører for diagnose, samt nye mål for terapi.

Denne metoden tillater videre undersøkelse av rollen som epigenetiske merker i nevrodegenerativ sykdom og kan endres for vurdering av menneskelige fibroblaster og induserte pluripotente stamceller. Denne metoden inneholder en rekke detaljer som må demonstreres visuelt, for eksempel riktig lasting av det vestlige flekkapparatet. Demonstrere prosedyren vil være Michel Fallah og Navin Rana, begge lavere forskere i Torrente laboratoriet.

Begynn med å restreaking gjær fra frosne glyserol aksjer på histidin 2% glukose agar selektive medium plater, for en to til tre dagers inkubasjon ved 30 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, inokulert restreaked gjær for hver over uttrykk modell og kontroll i fem milliliter av histidin selektiv væske medium. Supplert med 2% raffinose ved 30 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt, over natten.

Neste morgen, vokse 100 milliliter flytende kultur for hver av overexpression modeller og kontroller i selektive medier supplert med 2% galaktose over natten. Og mål den optiske tettheten på 600 nanometer eller OD600 for å bestemme volumet av overnattingskulturen som trengs for å gjengi over uttrykkskulturer ved en start OD600 på 0,3. For å indusere proteinoveruttrykk, dyrke gjæren på galaktosemedium med risting ved 30 grader Celsius for riktig eksperimentell tidsperiode.

Mål deretter OD600 for hver kultur på slutten av induksjonsperioden. Og standardiser alle celletellingene til den laveste OD600-verdien. Høst kulturene i 50 milliliter sentrifugerør ved sentrifugering og gjenoppuss pellets i en milliliter sterilt stilled vann for hver 10 milliliter kultur dyrket.

Aliquot en milliliter celleuspensjon i individuelle mikrocentrifuge rør for en ekstra sentrifugering og aspirere supernatantene. Deretter snap fryse celle pellets i flytende nitrogen for lagring på minus 80 grader celsius. For å lyse cellene for vestlig flekkanalyse, tin gjærcellepellets på is før gjenoppliving i 100 mikroliter destillert vann.

Tilsett 300 mikroliter med 0,2-molar natriumhydroksid og 20 mikroliter 2-Mercaptoethanol til hver celleprøve. Og resuspend pellets ved pipettering. Etter en 10 minutters inkubasjon på is, pellet cellene ved sentrifugering og resuspend prøvene i 100 mikroliter av lasting fargestoff.

Kok deretter prøvene i 10 minutter på en varmeblokk. Mens prøvene lyses, legg to geler i en gelholder og fyll det indre kammeret til toppen med løpebuffer og det ytre kammeret til to-gellinjemerket. Når prøvene er klare, last 15 mikroliter hver, cellelyseløsning, inn i hver brønn av de 10 brønnene, 12% polyakrylamidgel og legg til fem mikroliter proteinstige til proteinstigebanen godt.

Kjør gelen i ca. 45 minutter ved 150 volt eller til lasting fargestoff foran når bunnen av gelen. Mens gelen er i gang, suge to fiber pads per gel i overføring buffer og en polyvinyliden fluor, eller PVDF, membran per gel i metanol. Når gelen er klar, skyll membranen i overføringsbuffer og legg en pressoaked fiberpute på bunnen av en halvtørr overføringsapparatcelle.

Etterfulgt av PVDF-membranen, gelen og den andre presoderte fiberputen. Sett deretter strømmen til 150 milliamper i en time. På slutten av proteinoverføringen fjerner du membranen fra overføringsapparatet for en kort skylling med destillert vann.

Legg den skyllede membranen, proteinsiden opp i en liten fargeboks og dekk membranen med trisbufret saltvann eller TBS, blokkerer buffer i en time inkubasjon ved romtemperatur med mild gynge. På slutten av blokkeringsinkubasjonen inkuberer membranen over natten med et anti-gjær histone og modifiseringsspesifikt antistoff i TBS ved fire grader Celsius. Og et skikkelig kjernefysisk lastekontrollantistoff.

Neste morgen, vask membranen fire ganger i TBS, supplert med 0,1% polysorbat 20 i fem minutter med gynge ved romtemperatur per vask. Etter siste vask, inkuber blot med passende sekundære antistoffer i en time ved romtemperatur. Etterfulgt av fire, fem minutters vasker i TBST og en fem minutters vask i TBS alene med gynge.

Deretter bilde blot på en fluorescerende vestlige flekk forestille system i to minutter. Her er vekstundertrykkelse i faste og flytende kulturer vist med betydelige effekter på gjærvekst observert i nærvær av galaktose-infundert i sarkom overuttrykksmodeller. En signifikant reduksjon i histonenivåer er tydelige i den smeltede i sarkomoveruttrykksmodellen, og signifikante økninger i nivåene av histoneacetylering i TAR-bindingsproteinet 43 overuttrykksmodell, observeres som ikke ses i verken smeltet i sarkom eller alfa synuclein overexpression modell.

Det er også betydelige reduksjoner i histonenivåene i alfasynuclein-overuttrykksmodellen. I dette sukrose-tuning eksperimentet, jo lavere mengde galaktose som brukes til å indusere smeltet i sarkom overuttrykk, den lavere toksisiteten som observeres i både fast og flytende kultur. Viktigere, jo lavere nivå av smeltet i sarkom overuttrykk, jo mindre størrelsen på reduksjonen i histone nivåer.

Mens du utfører denne protokollen, er det viktig å standardisere mengden gjær i hver prøve for å muliggjøre en riktig sammenligning i nivåene av histone post-translational modifikasjon. 2-Mercaptoethanol bør brukes under en hette for å unngå innånding. Hvis Ponceau flekken brukes, må den kastes riktig.