Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

This content is Open Access.

JoVE Journal Immunology and Infection

Использование единой цепи MHC технологии расследовать Co агонизмом в человека CD8 + Т-клеток активации

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Journal (Immunology and Infection)

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Journal (Immunology and Infection)

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Click here for the English version

Использование единой цепи MHC технологии расследовать Co агонизмом в человека CD8 + Т-клеток активации

Article DOI: 10.3791/59126-v

February 28th, 2019 •

Xiang Zhao¹, Maryam Hamidinia¹, Joanna Ai Ling Choo¹, Chien Tei Too^1,2, Zi Zong Ho³, Ee Chee Ren⁴, Antonio Bertoletti³, Paul A. MacAry^1,2,5, Keith G. Gould⁶, Joanna Brzostek¹, Nicholas R.J. Gascoigne^1,2,5

¹Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, ³Emerging Infectious Diseases Program, Duke-NUS Graduate Medical School, ⁴Singapore Immunology Network, A*STAR, ⁵NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering (NGS), National University of Singapore, ⁶Department of Immunology, Wright-Fleming Institute, Imperial College London

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

February 28th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Этот протокол описывает использование одной цепи гистосовместимости комплексы для изучения молекулярных взаимодействий в активации клеток человека CD8 + T: поколение инженерии антиген представляющих клеток, выражая единую цепочку конструкции, культуры человеческого клона клеток CD8 + T и активация Т-клеток экспериментов.

Transcript

Нестимуляторные пептидные комплексы MHC не активируют Т-клетки, но могут усилить реакцию Т-клеток на агонистный пептид MHC. Этот протокол описывает экспериментальную систему для исследования коагонизма во время активации Т-клеток ЧЕЛОВЕКА CD8. Мы выражаем молекулы MHC как одноколесные комплексы с ковалентно-связанной тяжелой цепью, бета-2-микроглобулином и пептидом.

Это позволяет вводить мутации в молекулы MHC, представляя предопределенные пептиды. В этом протоколе используется клон CTN человека, специфичный для эпитопа вируса гепатита В. Понимание механизма коагонизма при реакциях Т-клеток против гепатита может способствовать развитию иммунотропов против этой вирусной инфекции.

Представленные методы могут быть использованы в исследованиях и других фундаментальных аспектах активации Т-клеток в Т-клеточных системах человека с известной специфичностью пептида MHC. В этом протоколе используются одноко цепи молекул MHC класса I человека, состоящие из последовательности сигналов, пептида интереса, связующих звенья, человека бета-2-микроглобулина linker, и MHC тяжелой цепи. Пептид E1A3 от гепатита В используется в качестве агонистного пептида.

Gag от ВИЧ используется в качестве нестимуляторного пептида. Однококлеточные молекулы МХК человека выражаются в линии клеток хомяка, содержащей тетрациклин-репрессор. Агонист однокоголовый MHC выражается с использованием тетрациклин-индуцированных плазмид, в результате чего очень низкий уровень экспрессии в отсутствие тетрациклина, и высокий уровень экспрессии в присутствии тетрациклина.

Клетки CHO, выражаюющие низкий уровень агонистного пептида MHC, трансфицированы составно выраженным нестимуляторным пептидом MHC. Использование этой экспериментальной системы позволяет сравнивать реакции Т-клеток с агонистным пептидом MHC при наличии или отсутствии нестимуляторного пептида MHC. Чтобы начать эту процедуру, культивировать CHO клетки в колбе Т-75, как указано в текстовом протоколе.

За день до эксперимента по активации Т-клеток, мыть клетки в колбе с PBS. Добавьте раствор, содержащий 05%трипсина и 2%EDTA в PBS, и инкубировать в течение пяти-десяти минут при комнатной температуре. Используя световой микроскоп, наблюдайте за клетками, чтобы убедиться, что они отделились.

Затем добавьте полный F12 в колбу, чтобы остановить трипсинизацию. Перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку. Центрифуга при 400G в течение пяти минут, и удалить супернатант либо трубопроводов или декантирования.

Повторно приостанавливайте гранулы ячейки в пяти миллилитров полного F12. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток и корректировки концентрации клеток до 200 000 клеток на миллилитр в CF12. Добавьте от 50 до 60 нанограмм на миллилитр тетрациклина в образцы только агониста, чтобы вызвать большое количество агонистного выражения класса PMHC I в качестве положительного контроля.

После этого смешайте клетки CHO либо вихрем, либо пипетки. Добавьте 100 микролитров клеточной подвески к каждому колодец пластины U-bottom 96-well. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.

За день до эксперимента центрифуга CTLS клетки при 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Используйте гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки, и повторно приостановить их при плотности одного миллиона клеток на миллилитр в полном человеческих Т-клеток без цитокинов или PHA. Инкубировать CTLs ночь на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.

На следующий день центрифуга Т-клеток в 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в 2 миллилитров полного без сыворотки мультимедиа. Используйте гемоцитометр для подсчета Т-клеток и корректировки их плотности до одного миллиона живых клеток на миллилитр в полных Т-клеточных средствах массовой информации человека.

Добавьте анти-человеческое антитело CD107a при разбавлении от одного до 100, и Brefeldin A при разбавлении от одного до 1000. Затем извлечения 96-хорошо пластины, содержащей клетки CHO. Используя стеклянную пипетку Pasteur, аспирировать средства массовой информации из клеток CHO.

Добавьте к каждой колодец 200 микролитров подвески Т-клеток. Со-культура Т-клеток с клетками CHO при 37 градусах по Цельсию с 5%-углеродным диоксидом в течение трех-четырех часов. В конце совместной культуры, центрифуга 96-хорошо пластины на 400 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.

Удалите супернатант, аспирируя или стряхивая. Затем добавьте 2,5 микролитров антител CD3 и 2,5 микролитров антител CD8 в 50 микролитров 5%BSA в PBS к каждой хорошо, для окрашивания поверхности клеток антигена, и смешать с помощью пипетки. Инкубировать образцы в темноте, и на льду, в течение 30 минут.

После этого добавьте 150 микролитров буфера для мытья к каждому хорошо, чтобы вымыть образцы. Центрифуга образцов в 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Удалите супернатант, аспирируя или стряхивая.

Установите комплект фиксации/пермеабилизации и добавьте 100 микролитров раствора фиксации/пермеабилизации к каждой колодец и пипетку для смешивания. Инкубировать на льду в течение 20 минут. Затем центрифуга пластины на 400 раз G при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.

Отбросьте супернатант и добавьте 200 микролитров буфера 1X perm/wash к каждой хорошо. Повторите этот процесс от центрифугации через добавление буфера завивки/мытья один раз. После этого повторно приостанавливают клетки в 50 микролитров буфера завивки/мытья, содержащего анти-интерферон-гамму с концентрацией 3 микрограмма на миллилитр.

Инкубировать на льду в темноте в течение 30 минут. Далее добавьте 150 микролитров буфера 1X perm/wash. Центрифуга при 400G, четыре градуса по Цельсию, в течение пяти минут.

Удалите супернатант и добавьте 200 микролитров буфера 1X perm/wash. Центрифуга пластины снова в 400 раз G, четыре градуса по Цельсию, в течение пяти минут, и удалить супернатант, аспирируя или стряхивая. Повторно приостанавливайте образец в 200 микролитров буфера для мытья и приступайте к цитометрическому анализу.

За день до эксперимента смешайте клетки ЧО либо вихрем, либо трубой. Затем добавьте один миллилитр клеточной подвески к каждому колодец из 12-хорошо пластины. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.

В день эксперимента используйте клеточный скребок, чтобы отделить клетки CHO от нижней части каждой хорошо. Перенесите один миллилитр средств массовой информации, содержащих клетки из каждой системы, в трубки FACS. Центрифуга при 400 градусах G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.

Повторно приостановить в 100 микролитров анти-HLA антитела разбавлены в буфере мытья. Инкубировать на льду в течение 30 минут. Затем добавьте один миллилитр буфера стирки в каждый образец CHO.

Центрифуга при 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Повторно приостанавливайте каждый образец в 3 миллилитров буфера стирки и приступайте к анализу цитометрии потока. В этом исследовании представлен надежный инструмент для исследования молекулярного взаимодействия во время положительной активации Т-клеток человека CD8.

Разработанная ксеногенная система генерируется, которая представляет низкие уровни агонистного pMHC при наличии или отсутствии агонистного pMHC. Эти инженерные БТРы затем используются для стимулирования E183-специфического человека CD8 положительный клон Т-клеток. Нетрансфицированные клетки CHO и CHO-клетки, выражают нестимуляторный одноко цепной комплекс Gag-MHC, не вызывают активации.

Экспрессия высоких уровней агонистного одномагнитного комплекса E183-MHC, который является положительным элементом управления, как считается, вызывает очень эффективное производство интерферона-гамма и дегрануляцию, демонстрируя, что одночегоночная конструкция E183 может быть распознана конкретным TCR для активации функций эффектора Т-клеток. Выражение низких уровней одноко цепью комплекса Е183-МХК вызывает более низкие уровни интерферон-гамма-производства и дегрануляции, что было усилено наличием нестимуляторного комплекса Gag-MHC. Обратите внимание, что очень высокий процент клеток CD107a-T наблюдается даже в ответ на низкие уровни антигенного pMHC, что согласуется с предыдущими исследованиями.

Однако наличие нестимуляторного комплекса Gag-MHC увеличивает CD107a МФО. Во время этой процедуры, очень важно контролировать агонист пептид MHC выражение для обеспечения равной агонистической презентации с или без нестимуляторного пептида. Очень важно количественно агонист пептид MHC выражение с использованием TCR-как антитела в каждом эксперименте.

Альтернативный подход заключается в использовании поддерживаемых липидных билейеров, или бисера, представляя фиксированное количество агонистного пептида MHC в присутствии нестимуляторного пептида MHC. Эти экспериментальные системы должны позволить тестирование нескольких нестимуляторных пептидных последовательностей для коагонизма. Одноклеточная технология MHC может быть использована для исследования молекулярных взаимодействий при активации Т-клеток CD4, а также для исследования неклассических молекул MHC.

Этот протокол использует человеческую кровь и человеческие клетки. Следуйте всем необходимым мерам предосторожности при работе с человеческой кровью, чтобы уменьшить риск передачи заболеваний, передающихся через кровь.

X

Simple Hit Counter