Environment
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Frittliggende Leaf analyser for å forenkle Gene Expression studier i potet under infestation av tygge insekt Manduca Sexta
Chapters
Summary May 15th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den presenterte metoden skaper naturlig herbivore skadet plante vev gjennom anvendelse av Manduca Sexta larver til frittliggende blader av potet. Anlegget vev er analyseres for uttrykk for seks transkripsjon faktor homologs involvert i tidlig svar på insekt herbivory.
Transcript
Denne protokollen bruker en strømlinjeformet tilnærming for måling av plantegenuttrykk som svar på insektens planteeter. Ved å bruke frittliggende blader isolert i Petri-retter, er insektene lettere å påføre og overvåke i løpet av den relativt korte perioden med angrep som bidrar til reproduserbare genuttrykksdata. Denne protokollen kan tilpasses mange plante-/insektinteraksjoner.
dersom grunnlinjeobservasjoner fra hele anleggssystemer vurderes. Den uforutsigbare naturen av insektfôring kan være utfordrende. Derfor gir en pålitelig tilførsel av riktig iscenesatte larver og sunne planter den beste sjansen for suksess.
Visualisering av hvordan sunne planter og insekter skal vises og oppføre seg er medvirkende til å oppnå optimale resultater, spesielt for forskere som er nye på studiefeltet. Demonstrere prosedyren med meg vil være Frances Perez, en molekylær biolog i genetisk forbedring av frukt og grønnsaker lab. For å forberede nodal spredt vev kultur potetplanter, først få Kennebec plantlets dyrket fra explant materiale med minst tre til fire noder.
Bruk et sterilt blad for å fjerne bladene kutte grenene nær hovedstammen og la omtrent to millimeter grenvev per blad. Skjær omtrent to millimeter over og under hver node for å fjerne nodale seksjoner fra stilkene og ordne nodale borekaklinger i et sterilt vevskulturfartøy som inneholder nodal overføringsmedium med grenen pekende opp. Deretter overfører nodal borekaklinger til et plantevevskulturkammer for to til tre uker med vekst ved 24 grader Celsius og en 16-timers lys, åtte timers mørk fotoperiode.
For å forberede insekter for fôring, få ønsket larvalstadium av M.sexta og overfør en larve til hver brønn av et passende inneslutningsfartøy i henhold til larvens størrelse. Lag plasseringsmaler for hvert innhøstingstidspunkt ved hjelp av fem solide skuffer som er i stand til å holde et sett med seks petriskåler i riktig størrelse foret med hvitt papir. Spor et sett med seks sirkler ved hjelp av petriskålen i riktig størrelse på papiret i hver skuff og merk ett sett med sirkler kontroll A, B og C og den andre infiserte A, B og C.Deretter merke hver plassering mal med riktig innhøstingstid.
Deretter merker du ett 1,7 milliliter mikrocentrifugerør for hver sirkel i plasseringsmalen for å identifisere perturbasjonen, plantereplikasjonsbrevet og høstetidspunktet på en hensiktsmessig måte. Når alle rørene er merket, plasserer du en steril filterpapirplate i en petriskål per mal og fukter platene med sterilt vann uten å la overflødig væskebasseng i hver tallerken. Legg deretter en tallerken i hver sirkel i hver plasseringsmal og legg tre potetplanter på samme alder og relativ størrelse ved siden av hver plasseringsmal.
For å starte angrepet, bruk steril saks for å fjerne de to øverste størrelsen matchet blader fra hver plante og legg ett blad i kontrollen Petri parabolen og en i den infiserte Petri parabolen for hver plante så raskt som mulig. Når alle bladene er plassert, bruk myke berørings tang til å overføre minst en larve til hver infiserte tallerken så raskt som mulig og stille inn timeren for ønsket angrepstid. Vær oppmerksom på fôringen for å sikre at alle larver spiser, og erstatter eventuelle ikke-fôring larver etter behov.
Fjern alle larver fra alle bladene på slutten av angrepstiden og start timeren for innhøstingen. På slutten av hvert innhøstingstidspunkt, overfør hvert blad til det tilsvarende røret og slipp umiddelbart røret i flytende nitrogen for å fryse bladprøven før lagring på minus 80 grader Celsius til RNA-isolasjon. Sunne nøyaktig iscenesatte larver bør begynne å mate umiddelbart etter plassering på bladoverflaten, og fôringen skal fortsette på en ganske konsekvent måte gjennom angrepsperioden.
Larven på bunnen av dette bladet brukte ikke noe plantemateriale og er et eksempel på et mislykket angrep. Disse bladene ble løsrevet fra to uker gamle nodal forplantet vev kultur planter og konsumert til forskjellige priser og fôring stiler for hvert larval stadium. Basert på disse resultatene ble fjerde instar larver valgt for å ytterligere vurdere skade på blader for mer modne jorddyrkede potetplanter som nærmere omtrentlig feltdyrket potetplanter.
I disse genuttrykksstudiene ble to nye C2H2 sinkfingertranskripsjonsfaktorer som er robust lydhøre overfor M.sexta planteeteri identifisert som støtter bruk av frittliggende blader for angrepsanalyser. Husk å bruke alder og størrelse matchet blader og å riktig iscenesette larver for hvert eksperiment som ensartethet resulterer i mer reproduserbare data. Bladvev kan analyseres for stress-indusert reaktive oksygenarter og jasmonsyre hormon derivater.
Hele transkripsjons-, proteom- eller mikrobiomestudier kan også utføres på bladvevet.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
