Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca^{2 +}-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Onze tests kunnen worden gebruikt om verbindingen te testen op hun effecten op de menselijke spermacelfunctie. Specifiek, kunnen deze methodes worden gebruikt om grote aantallen samenstellingen snel en gemakkelijk voor hun gevolgen op het signaleren van calcium en acrosome reactie in menselijke spermacellen te screenen. Visuele demonstraties van deze methode zal het gemakkelijker maken voor anderen om het opzetten van soortgelijke experimenten in hun eigen laboratoria.

Begin met het plaatsen van een 50 milliliter buis per een milliliter van ruwe sperma monster in een buis rek in een hoek van 45 graden en het toevoegen van vier milliliter van 37 graden Celsius Human Tubal Fluid of HTF positief medium aan elke buis. Vervolgens voorzichtig pipette een milliliter van vloeibaar sperma monster aan de onderkant van elke buis en plaats de buizen op 37 graden Celsius voor een uur. Gebruik aan het einde van de incubatie een aangepaste pipettip die in een hoek van 45 graden wordt gehouden om zo veel van de bovenste fractie van de motile spermacel met HTF-positief medium zo veel mogelijk over te brengen in een nieuwe plastic buis van 15 milliliter.

Om de verzamelde spermacellen te tellen, verdun een 20 microliter aliquot tot een factor van 10, 20, 30, 50, of 90 in S100 buffer in een ronde bodem twee milliliter buis volgens de verwachte concentratie. Vortex de verdunde spermacellen gedurende 10 seconden bij 700 rotaties per minuut. Vervolgens dompel je een SP1-cassette onder in het monster en druk je de witte zuiger volledig in om een aliquot van het monster in de cassette te dompelen.

Plaats vervolgens de cassette in de image cytometerlade en voer de PI bevlekte menselijke zaadceltest uit volgens de toegepaste verdunningsfactor. Om veranderingen in de vrije intracellulaire calciumconcentratie te meten, pipette het spermamonster een keer op en neer en gebruik een automatische repeaterpipet om 50 microliters fluorofofoorcellen te aliquot tot 24 putten van een rij van een 384 microputplaat. Plaats de microputplaat in de fluorescentieplaatlezer op 30 graden Celsius en selecteer het juiste protocol voor fluorofoof.

Selecteer een put in de rij spermacellen en pas de winst aan op een doelwaarde van 20%Start vervolgens met de meting. Na 10 basislijncycli pauzeert u het experiment en werpt u de lade uit met de microputplaat. Met behulp van een 12-kanaals pipet, snel 25 microliters van de voorbereide oplossingen van verbindingen en controles van belang in de 12 dubbele putten in de rij en onmiddellijk terug de plaat aan de lezer om de meting zo snel mogelijk voort te zetten.

Eventuele veranderingen in fluorescentie in reactie op de toevoeging van de verbindingen of controles zullen worden vastgelegd door het instrument. Voor acrosome reactieanalyse, na het uitbroeden van de capacitated spermacellen met de aangewezen fluorescerende kleurstoffen, samenstellingen of controles, meng de steekproeven door pipetting en voeg 50 microliter van elk testmonster aan 100 microliter van immobilisatieoplossing toe. Meng de monsters opnieuw en laad de kamers van één A2-dia per monster met ongeveer 30 microliter monster per kamer.

Plaats vervolgens de eerste geladen dia op de lade van de afbeelding cytometer. Selecteer het FlexiCyte-protocol en druk op Uitvoeren. Hier representatieve resultaten van een experiment testen van het effect van vier verbindingen, een positieve progesteron controle en een negatieve buffer controle met behulp van de gemiddelde doorvoer calcium signalering test als aangetoond kan worden waargenomen.

In deze grafiek wordt een dosisresponscurve van progesteron weergegeven die is afgeleid van piekprocenten veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie veroorzaakt door serieel verdunde concentratie progesteron. Deze gegevens illustreren de effecten van een negatieve of een van de twee positieve controles op de inductie van een acrosome reactie in capacitated menselijke spermacellen in een medium doorvoer acrosome reactietest. Om te voorkomen dat de pieken van de geïnduceerde signalen ontbreken, is het van cruciaal belang om de chemicaliën snel toe te voegen aan de replicerende putten en de meting daarna onmiddellijk voort te zetten.

Door het type fluoroforen en kleurstoffen te veranderen, kunnen onze tests eenvoudig worden aangepast om verschillende wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Deze tests zijn al gebruikt in verschillende studies om grote groepen verbindingen te testen op hun effecten op de menselijke spermafunctie.