Biochemistry
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포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학
Chapters
Summary May 16th, 2019
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배양 된 일차 또는 확립 된 세포 주는 일반적으로 동물 모델을 사용 하기 전에 초기 접근법으로 서 근본적인 생물학적 및 기계적 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 아연 (Zn) 및 원자 흡 광도 분광학이 있는 다른 미 량 원소 연구를 위해 전체 세포 추출 물과 세포 분 획을 준비 하는 방법을 설명 합니다.
Transcript
포유류 발달에서 전이 금속의 역할은 크게 과소 평가된다. 새로운 증거는 금속 항상성 세포와 조직의 발달 단계에 따라 변경 계속 것을 보여줍니다. 또한, 금속의 특정 셀룰러 대상은 또한 개발에 품종, 물론, 그것은 그들의 위치를 식별 하기 어려운.
현재까지 금속을 정량화하기 위해 다른 분석 기술이 개발되었지만 대부분은 비싸거나 접근 할 수 없습니다. 집중적인 연구는 보다 접근가능하고 효율적인 방식으로 금속 측정을 개선하는 데 중점을 두고 있습니다. 흑연 용광로 원자 흡수 분광법, GF-AAS는 두 가지 주요 장점이 있습니다.
아연에 대한 검출 의 낮은 한계를 제공하므로 정확한 추적 아연 분석을 가능하게 합니다. 또한 대량의 시료를 필요로 하지 않는 기술이며, 마이크로리터의 용액은 분석을 수행하기에 충분합니다. 이 두 가지 장점의 조합은 GF-AAS가 낮은 부피 샘플에서 미량 요소를 분석하는 데 이상적입니다.
몇몇 인간적인 병리학 조건은 금속 잘못 균형과 관련이 있습니다. 몇몇 보기는 빈혈증, 곡예염 장병증 및 윌슨의 및 Menkes's 질병입니다. 따라서 높은 감도와 정확도로 생물학적 샘플에서 전이 금속 의 수준을 측정하는 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것이 중요합니다.
GF-AAS는 정상적인 생리적 조건및 병원성 사례에서 주어진 금속의 결정을 용이하게 하는 기술에 대한 훌륭한 예입니다. 이 방법은 매우 다재다능합니다. 그것은 많은 시스템에 적용 될 수 있으며 많은 요소는 GF-AAS를 사용하여 분석 될 수있다.
문제는 실제로 검출 방법 한계를 설정하여 샘플이 이 한계 내에 있는지 확인하는 것입니다. 샘플의 양이 적다는 사실을 감안할 때, 테스트할 여지가 많지 않으므로 처음부터 신중하게 데이터를 검사해야 합니다. 시료의 첫 번째 분석 후, 우리는 정량화에 필요한 한계에 샘플을 가지고 하는 데 필요한 희석 계수의 무엇을 설정 해야.
AAS에 가기 전에 핵을 제대로 분수할 수 있는지 확인하십시오. 웨스턴 블롯은 분광 분석 전에 항상 좋은 검증입니다. GF-AAS는 낮은 볼륨을 필요로 하는 동안, 세포 내 풀은 이미 낮은 볼륨에.
이는 테스트할 여지가 거의 없습니다. 첫 번째 측정은 신중하게 수행하고 검사해야 하므로 샘플 처리를 단 하나의 희석 계수로 최소화할 수 있습니다. 시작하려면 55 평방 센티미터 플레이트에 관심있는 세포를 배양합니다.
진공 트랩을 사용하여 문화 미디어를 흡인합니다. 미디어의 모든 흔적을 제거해야 합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS를 사용하여 원하는 시점이나 배양 조건으로부터 세포를 세 번 헹구는 다.
그런 다음 접시에 얼음 차가운 PBS 1 밀리리터를 추가하고 접시에서 세포를 긁어 냅니다. 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 원심분리기는 10초, 000회 G에서 10초 동안, 포부로 상부를 제거합니다.
세포질 및 핵 분획의 금속 분석이 바람직한 경우, 0.1%NP-40, 비이온 세제를 포함하는 얼음 감기 PBS의 400 마이크로리터에서 세포 펠릿을 재중단한다. 100 마이크로리터를 새로운 미세원심분리기 튜브로 전신 샘플로 전송하고 영하 20도에서 저장합니다. 핵을 분리하려면 P1000 마이크로파이펫 팁을 사용하여 400 마이크로리터 셀 서스펜션을 얼음에서 5~10회 위아래로 피펫합니다.
그런 다음, 셀 서스펜션의 5개의 마이크로리터를 추출하여 현미경 유리 슬라이드로 옮기. 핵 무결성을 확인하기 위해 40배의 목표를 사용하여 5개의 마이크로리터를 가벼운 현미경 아래에 놓습니다. 원심분리기 나머지 395 마이크로리터 셀 용액 은 10초에서 10초 동안 정지현수, 000배 G.Transfer를 새로운 미세원심분리기 튜브로 분리한다.
다음으로, 0.1%NP-40을 함유한 PBS의 마이크로리터 500을 추가하여 핵 분획으로 펠릿을 헹구고, 원심분리기는 10초에서 10초, 000배 G.는 상퍼를 제거하고, 동일한 용액의 100마이크로리터에 핵을 함유한 펠릿을 재연한다. 세포를 lyse하려면 Bioruptor를 사용하여 전체 세포와 핵함유 용액을 5분 동안 각각 세 번 초음파 처리합니다. 핵 또는 세포분획에 특이적인 항체를 사용하여 서양 얼룩에 의한 분획의 순도의 품질 관리를 수행합니다.
첫째, 전세포, 세포질 및 100 마이크로리터를 함유한 세포질 및 100마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로센티슈에 함유한 미량 금속 등급의 농축 된 질산의 동일한 부피를 1시간 동안 세포 배양을 미네랄화하기 위해 열 블록에 배치한다. 그 후, 열 블록에서 튜브를 꺼내 20섭씨에서 하룻밤 동안 산 소화를 계속랙에 놓습니다. 과산화수소의 시료 부피의 30%를 첨가하여 반응을 중지합니다.
18 메가 옴 정제 수와 500 마이크로 리터에 샘플 볼륨을 가져. 다음으로, 15 밀리리터 팔콘 튜브에서 18 메가 옴스의 정제수에서 분석 등급 표준 산화 질소 산화물을 희석하여 교정 중에 빈 용액으로 2부량 의 질산 용액을 준비합니다. 그런 다음, 2부피 퍼센트 질산 용액을 사용하여 10억 분의 1, 000부품의 농도로 시판 가능한 1, 000 ppm 아연 스톡 용액을 희석한다.
1, 000분당 1, 000부, 100부, 100부, 100부, 25ppb로 희석하여 2부피% 질산 용액으로 직접 희석한다. 질산 마그네슘 매트릭스 수식제 1밀리리터를 폴리프로필렌 샘플 컵에 넣고 컵을 오토샘플러 회전 목마에 넣습니다. 원자 흡수 분광계를 프로그래밍하여 매트릭스 수정기의 5마이크로리터를 아연 표준 및 빈값에 자동으로 추가합니다.
표준 솔루션 및 샘플에 대한 원자 흡수 분광계에 동일한 최적화된 조건을 설정하여 분당 250 밀리리터의 도입 유량, 섭씨 20도의 분사 온도, 흑연 용광로 온도가 4단계 공정에서 섭씨 1, 800도에 도달합니다. 단일 실험의 모든 표준 및 샘플은 교정 차이 또는 증발로 인한 실수를 피하기 위해 동시에 측정되어야 합니다. 램프 C-HCL을 20암페어, 파장 213.9나노미터, 0.7나노미터의 슬릿으로 최적화합니다.
폴리프로필렌 샘플 컵에 샘플을 피펫하고 자동 샘플러 회전 목마에 넣습니다. 아연 검출의 하한은 10억 개당 0.01부품이다. 기준의 농도를 증가시킴으로써 아연 검출의 상한선은 10억 개당 20개 부품으로 결정된다.
아연 표준 곡선을 얻은 후 광물화된 샘플을 측정하여 금속 함량을 결정합니다. 얻어진 데이터가 검출 한계를 초과하는 경우, 0.1%의 분석등급 질산으로 처리된 18메가옴 정제수로 샘플을 희석시키게 한다. 핵 프로토콜의 이 급속한 격리에서, 1차 근세포에서 대표적인 서쪽 얼룩은 세포전 분획의 순도를 나타낸다.
크로마티닌 리모델링 효소 Brg1은 핵 분획을 식별하는 데 사용되었고, 튜룰린은 세포분획을 식별하는 데 사용되었다. 이 수치는 각 세포 유형의 증식 및 분화 또는 수렴 단층층, 그리고 전체 세포 추출물, 세포종 및 핵 분획에 해당하는 아연 함량을 확산및 분화하기 위한 대표적인 빛 현미경을 보여줍니다. 이 연구에서 분석된 모든 세포주들은 나노몰라 범위의 아연 농도를 보였다.
분화 된 1 차 심모튜브는 증식 세포보다 아연의 높은 수준을 나타냈다. 아연의 유사한 세포 전염분포는 신경모세포종 유래 세포주 N2A에서 검출되었다. 한편, 확립된 3T3-L1 세포주들은 사전 아디포세포가 유도되거나 분화되었을 때보다 증식되었을 때 더 높은 수준의 아연을 나타냈다.
MCF10A 세포는 증식 세포에서 세포와 핵 분획 사이의 아연의 동등한 수준을 보였다. MCF10A 세포가 합류하면 전세포 아연 수치가 40% 감소하는 것이 감지되었고, 금속은 세포분획에 가장 집중된 것으로 나타났다. 흑연 용광로 원자 흡수 분광법은 생물학적 및 환경 샘플에서 전이 및 중금속을 측정하는 매우 민감한 기술입니다.
최소한의 오염으로 인해 장비의 감도로 인해 분석에 방해가 되기 때문에 세포 전 분획 을 준비하는 데 특별한 주의와 청결을 취해야 합니다. 모든 실험에서 낮은 볼륨과 미량의 금속 수준을 감안할 때 GF-AAS보다 아연을 측정하는 더 좋고 정확한 기술을 생각하기가 어렵습니다. GF-AAS의 상대적으로 낮은 비용으로 필요한 검출 의 한계와 낮은 부피를 제공할 수 있는 현재 기술은 없습니다.
흑연 용광로 원자 흡수 분광법은 정확하고 민감하며 비용 효율적이며 접근 가능합니다. 원소 검출 기술이 계속 발전함에 따라 이 분석 기법은 계속 개선될 것입니다. GF-AAS에 의한 아연 및 기타 금속 검출을 위한 향후 응용 프로그램에는 전신 금속 불균형과 관련된 질병 환자로부터 장기, 동물 모델에서 얻은 조직 및 생검이 포함됩니다.
질산은 매우 빠르게 심한 화학 적 화상을 일으킬 수있는 매우 부식성 산이다. 이 화학 물질은 또한 금속 분말 과 같은 특정 화합물과 격렬하게 반응할 수 있습니다. 질산에 의해 제기 되는 위험 때문에, 그것은 질산을 처리 할 때마다 엄격한 안전 조치를 취하는 것이 중요.
질산을 취급할 때 우리는 환기가 적당하지 않은 경우에 안전 화학 안경, 방수, 장갑 및 승인된 증기 호흡을 위한 얼굴 방패를 착용하는 것을 강력히 추천합니다.
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