Biochemistry
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परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी स्तनधारी कोशिकाओं में Intracellular जस्ता पूल को मापने के लिए
Chapters
Summary May 16th, 2019
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सुसंस्कृत प्राथमिक या स्थापित कोशिका रेखाएँ सामान्यतः पशु मॉडलों का उपयोग करने से पहले एक प्रारंभिक दृष्टिकोण के रूप में मौलिक जैविक और यंत्रवादी प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग की जाती हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे पूरे सेल निष्कर्षों और जस्ता (Zn) और परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ अन्य ट्रेस तत्वों के अध्ययन के लिए subcellular भागों तैयार करने के लिए ।
Transcript
स्तनधारी विकास में संक्रमण धातुओं की भूमिका को काफी हद तक कम करके आंका जाता है। उभरते सबूतों से पता चलता है कि धातु होमोस्टेसिस कोशिकाओं और ऊतकों के विकास के चरण के अनुसार बदलता रहता है। इसके अलावा, धातुओं के विशिष्ट सेलुलर गंतव्यों को भी विकास में वैरायटी, और निश्चित रूप से, उनके स्थान की पहचान करना चुनौतीपूर्ण है।
आज तक, धातुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकविकसित की गई हैं, लेकिन अधिकांश महंगे या दुर्गम हैं। गहन अनुसंधान एक अधिक सुलभ और कुशल तरीके से धातु निर्धारण में सुधार करने के लिए केंद्रित है । ग्रेफाइट फर्नेस एटॉमिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी, जीएफ-आस, दो मुख्य फायदे हैं।
यह जस्ता के लिए पता लगाने की कम सीमा प्रदान करता है, सटीक ट्रेस जस्ता विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । यह भी एक तकनीक है कि नमूना की उच्च मात्रा की आवश्यकता नहीं है, समाधान के माइक्रोलीटर विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए पर्याप्त हो जाते हैं । इन दो फायदों का संयोजन कम मात्रा के नमूनों में ट्रेस तत्वों का विश्लेषण करने के लिए जीएफ-एएएस आदर्श बनाते हैं।
कई मानव रोग की स्थिति धातु के गलत संतुलन से संबंधित हैं। कुछ उदाहरण एनीमिया, एक्रोडरमेटाइटिस आंत्रोपैथिक, और विल्सन और मेनक्स रोग हैं। इसलिए, उच्च संवेदनशीलता और सटीकता के साथ जैविक नमूनों में संक्रमण धातुओं के स्तर को मापने के लिए कुशल और विश्वसनीय तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है।
GF-AAS एक तकनीक पर एक उत्कृष्ट उदाहरण है जो सामान्य शारीरिक स्थितियों में और रोगजनक मामलों में किसी भी धातु के निर्धारण की सुविधा प्रदान करता है। विधि बहुत बहुमुखी है। इसे कई प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है और कई तत्वों का GF-AAS का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है।
चुनौतियां वास्तविकता में पता लगाने की विधि सीमा स्थापित करने के लिए कर रहे हैं, सुनिश्चित करें कि नमूने इस सीमा के भीतर आते हैं । इस तथ्य को देखते हुए कि नमूनों की मात्रा कम है, परीक्षण के लिए बहुत गुंजाइश नहीं है, इसलिए डेटा की सावधानीपूर्वक जांच शुरू से ही होने की आवश्यकता है। नमूनों के पहले विश्लेषण के बाद, हमें यह स्थापित करने की आवश्यकता है कि नमूनों को मात्राकरण के लिए आवश्यक सीमा तक लाने के लिए क्या कमजोर पड़ने वाला कारक है।
सुनिश्चित करें कि आप आस में जाने से पहले नाभिक को ठीक से आंशिक करने में सक्षम हैं। स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण से पहले पश्चिमी ब्लॉट्स हमेशा अच्छे सत्यापन होते हैं। जबकि GF-AAS कम मात्रा की आवश्यकता है, इंट्रासेलुलर पूल पहले से ही कम मात्रा में हैं ।
जो परीक्षण के लिए थोड़ा कमरा देता है । पहले माप को सावधानीपूर्वक किए जाने और जांच करने की आवश्यकता है, इसलिए नमूना उपचार को केवल एक कमजोर पड़ने वाले कारक में कम किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, 55 वर्ग सेंटीमीटर प्लेटों में रुचि की कोशिकाओं को संस्कृति।
संस्कृति मीडिया को आकांक्षी करने के लिए वैक्यूम जाल का उपयोग करें। मीडिया के सभी निशान को हटाने के लिए सुनिश्चित करें। वांछित समय बिंदुओं, या संस्कृति की स्थिति, तीन बार से कोशिकाओं को कुल्ला करने के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त बर्फ ठंड PBS का उपयोग करें।
फिर थाली में बर्फ ठंड PBS के एक मिलीलीटर जोड़ें, और थाली से कोशिकाओं परिमार्जन । सेल निलंबन को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे बर्फ पर रखें। 10 सेकंड के लिए 10, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र, और आकांक्षा द्वारा सुपरनैंट निकालें।
यदि साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों का धातु विश्लेषण वांछित है, तो 0.1% एनपी-40, एक गैर-आयनिक डिटर्जेंट वाले आइस कोल्ड पीबीएस के 400 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। पूरे सेल नमूने के रूप में एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें, और इसे शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नाभिक को अलग करने के लिए, बर्फ पर पांच से 10 बार 400 माइक्रोलीटर सेल सस्पेंशन को ऊपर और नीचे करने के लिए P1000 माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करें।
फिर, सेल सस्पेंशन के पांच माइक्रोलीटर निकालें और इसे माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें। नाभिक अखंडता को सत्यापित करने के लिए 40 गुना उद्देश्य का उपयोग करके पांच माइक्रोलीटर को हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। सेंट्रलाइज शेष 395 माइक्रोलीटर सेल 10 सेकंड के लिए निलंबन को 10, 000 बार जी ट्रांसफर करें साइटोसोलिक अंश वाले सुपरनेट को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
इसके बाद, परमाणु अंश के साथ गोली कुल्ला करने के लिए 0.1% एनपी-40 युक्त पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और 10 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र 10, 000 बार जी को हटा दें, और एक ही समाधान के 100 माइक्रोलीटर में नाभिक युक्त गोली को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को lyse करने के लिए, एक बायोरूपर का उपयोग करने के लिए पूरे सेल और नाभिक युक्त समाधान तीन बार, प्रत्येक पांच मिनट के लिए सोनीकेट । परमाणु या साइटोसोलिक अंशों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके, पश्चिमी दाग द्वारा अंशों की शुद्धता की गुणवत्ता नियंत्रण करने के लिए आगे बढ़ें।
सबसे पहले, पूरे सेल में ट्रेस मेटल ग्रेड के केंद्रित नाइट्रिक एसिड की बराबर मात्रा जोड़ें, साइटोप्लाज्मिक और 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में सेल सस्पेंशन के 100, 500 और 100 माइक्रोलीटर युक्त परमाणु अंश, और उन्हें एक घंटे के लिए कोशिका संस्कृति को खनिज बनाने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल ब्लॉक में रखें। उसके बाद, थर्मल ब्लॉक से ट्यूबों को बाहर निकालें और उन्हें एक रैक में रखें ताकि एसिड पाचन को रात भर 20 डिग्री सेल्सियस पर जारी रखें। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के नमूने की मात्रा का 30% जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
18 मेगा ओम शुद्ध पानी के साथ 500 माइक्रोलीटर के लिए नमूना मात्रा लाओ। इसके बाद, 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब पतला विश्लेषणात्मक ग्रेड मानक नाइट्रिक ऑक्साइड में शुद्ध पानी में 18 मेगा ओम पर अंशांकन के दौरान खाली समाधान के रूप में दो मात्रा प्रतिशत नाइट्रिक एसिड समाधान तैयार करने के लिए । फिर, प्रति अरब 1, 000 भागों की एकाग्रता के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 1, 000 पीपीएम जिंक स्टॉक समाधान को पतला करने के लिए दो वॉल्यूम प्रतिशत नाइट्रिक एसिड समाधान का उपयोग करें।
1, 000 भाग प्रति मिलियन जिंक मानक समाधान, 1, 000 भाग प्रति बिलियन समाधान से काम करने वाले मानक समाधान तैयार करें, फिर इसे 2 वॉल्यूम प्रतिशत नाइट्रिक एसिड समाधान के साथ सीधे 5, 8, 10, 15, 20 और 25 पीपीबी तक पतला करें। पॉलीप्रोपाइलीन नमूना कप में 0.1% मैग्नीशियम नाइट्रेट मैट्रिक्स संशोधक का एक मिलीलीटर रखें, और फिर कप को ऑटोसम्पलर हिंडोला में लोड करें। परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमीटर स्वचालित रूप से जस्ता मानकों और खाली करने के लिए मैट्रिक्स संशोधक के पांच माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए कार्यक्रम ।
मानक समाधानों और नमूनों के लिए परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमीटर पर एक ही अनुकूलित स्थिति निर्धारित करें, परिचय प्रवाह दर 250 मिलीलीटर प्रति मिनट, इंजेक्शन तापमान 20 डिग्री सेल्सियस पर, और ग्रेफाइट फर्नेस तापमान चार चरण प्रक्रियाओं में 1, 800 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के साथ। अंशांकन मतभेदों या वाष्पीकरण के कारण गलतियों से बचने के लिए एक ही प्रयोग के सभी मानकों और नमूनों को एक ही समय में मापा जाना चाहिए। लैंप सी-एचसीएल को 20 amps की धारा, 213.9 नैनोमीटर की तरंगदैर्ध्य और 0.7 नैनोमीटर के भट्ठा को अनुकूलित करें।
पॉलीप्रोपाइलीन नमूना कप में नमूनों को पिपेट करें, और उन्हें ऑटोसंप्लर हिंडोला में रखें। जिंक का पता लगाने की निचली सीमा प्रति अरब 001 भाग है। मानकों की एकाग्रता बढ़ाकर जिंक का पता लगाने की ऊपरी सीमा प्रति अरब 20 भागों के लिए निर्धारित है ।
जिंक मानक वक्र प्राप्त होने के बाद, धातु की सामग्री निर्धारित करने के लिए खनिज नमूनों को मापें। यदि प्राप्त डेटा का पता लगाने की सीमा से परे है, तो 0.1% विश्लेषणात्मक ग्रेड नाइट्रिक एसिड के साथ उपचारित 18 मेगा ओम शुद्ध पानी के साथ नमूनों को पतला करें। नाभिक प्रोटोकॉल के इस तेजी से अलगाव में, प्राथमिक मायोब्लास्ट को अलग करने से एक प्रतिनिधि पश्चिमी दाग उपकोशिकीय अंशों की शुद्धता को दर्शाता है।
क्रोमेटिन रिमॉडलर एंजाइम Brg1 का इस्तेमाल परमाणु अंश की पहचान करने के लिए किया गया था, और ट्यूबलिन का उपयोग साइटोसोलिक अंश की पहचान करने के लिए किया गया था। यह आंकड़ा प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रसार और विभेदित या संकुचित मोनोलेयर के लिए प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोग्राफ दिखाता है, और पूरे सेल अर्क, साइटोसोलिक और परमाणु अंशों में संबंधित जस्ता सामग्री। इस अध्ययन में विश्लेषण की गई सभी सेल लाइनों ने नैनोमोलर रेंज में जिंक सांद्रता दिखाई ।
विभेदित प्राथमिक मायोट्यूब ने कोशिकाओं के प्रसार की तुलना में जिंक के उच्च स्तर का प्रदर्शन किया। न्यूरोब्लास्टोमा व्युत्पन्न सेल लाइन N2A में जिंक के समान उपकोशिकीय वितरण का पता चला। दूसरी ओर, स्थापित 3T3-L1 सेल लाइन जस्ता के उच्च स्तर का प्रदर्शन किया जब पूर्व adipocytes जब वे प्रेरित या विभेदित थे की तुलना में पैदा कर रहे थे ।
MCF10A कोशिकाओं ने कोशिकाओं के प्रसार में साइटोसोलिक और परमाणु अंशों के बीच जस्ता के बराबर स्तर दिखाया । एक बार MCF10A कोशिकाओं संगम तक पहुंचने, पूरे सेल जस्ता के स्तर में ४०% की कमी का पता चला था, और धातु साइटोसोलिक अंश में सबसे अधिक केंद्रित पाया गया था । ग्रेफाइट फर्नेस परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमेट्री जैविक और पर्यावरणीय नमूनों में संक्रमण और भारी धातुओं को मापने के लिए एक बेहद संवेदनशील तकनीक है।
उपकोशिकीय अंशों की तैयारी में विशेष देखभाल और सफाई ली जानी चाहिए, क्योंकि उपकरणों की संवेदनशीलता के कारण न्यूनतम संदूषण विश्लेषण में हस्तक्षेप करेगा। हर प्रयोग में धातुओं की कम मात्रा और ट्रेस स्तर को देखते हुए, जीएफ-आस की तुलना में जिंक को मापने के लिए बेहतर और अधिक सटीक तकनीक के बारे में सोचना मुश्किल है। कोई वर्तमान तकनीक नहीं है कि पता लगाने की सीमा और कम GF-AAS की अपेक्षाकृत कम लागत पर आवश्यक मात्रा प्रदान कर सकते हैं ।
ग्रेफाइट फर्नेस परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमेट्री सटीक, संवेदनशील, लागत प्रभावी और सुलभ है। इस विश्लेषणात्मक तकनीक में सुधार जारी रहेगा क्योंकि मौलिक पहचान प्रौद्योगिकियों में आगे बढ़ना जारी है । GF-AAS द्वारा जस्ता और अन्य धातुओं का पता लगाने के लिए भविष्य के आवेदन अंगों, पशु मॉडल से प्राप्त ऊतकों, और प्रणालीगत धातु असंतुलन के साथ जुड़े रोगियों से बायोप्सी शामिल होंगे ।
नाइट्रिक एसिड एक बेहद संक्षारक एसिड है जो बहुत तेजी से गंभीर रासायनिक जलने का कारण 100 00 00 000 है। यह रसायन धातु पाउडर जैसे कुछ यौगिकों के साथ हिंसक प्रतिक्रिया भी कर सकता है। नाइट्रिक एसिड से उत्पन्न खतरे के कारण, नाइट्रिक एसिड से निपटने के लिए सख्त सुरक्षा उपाय करना महत्वपूर्ण है।
नाइट्रिक एसिड को संभालते समय हम दृढ़ता से सलाह देते हैं कि यदि वेंटिलेशन पर्याप्त नहीं है तो आप सुरक्षा रासायनिक चश्मा, छप सुरक्षा, दस्ताने और अनुमोदित वाष्प श्वसन के लिए चेहरा ढाल पहनें।
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