En komplet pipeline til isolering og sekvensering af MicroRNAs og analyse af dem ved hjælp af open source-værktøjer

Vi har udviklet en defineret, reproducerbar og mangeårig protokol for små RNA-sekventering og til analyse af normaliserede læsninger ved hjælp af opensource bioinformatik værktøjer. De vigtigste fordele ved vores strategi er, at den præcist indsamler mikroRNA’er gennem gelrensning, og at bioinformatikanalysen kan anvendes, uanset hvordan mikroRNA’erne indsamles. Høj overførselssekvensering af microRNAs kan afsløre indsigt i sygdomsmekanismer, behandling af mikroRNA’er og den nøjagtige kvantificering af genterapi tilgange, der leverer små RNA’er.

Sørg for at arbejde i et RNase frit miljø og for at holde alle RNA-produkterne på is under hele proceduren. Visualisering af gelskæringstrinnene vil hjælpe seerne med at identificere den korrekte størrelse af de produkter, der kræves til downstream-applikationer. For tre prime adapter ligation, kombinere 11 mikroliter af RNA med 1,5 mikroliter af ATP fri 10X T4RNA ligase reaktion buffer, en mikroliter af polyethylenglycol, og 0,5 mikroliter af tre prime linker.

Prøverne opvarmes ved 95 grader Celsius på en termocyr i 30 til 40 sekunder efterfulgt af afkøling på is i et minut. Tilføj en mikroliter af T4RNA ligase to og inkuber reaktionen ved stuetemperatur i to timer. Mens prøverne inkuberes, hældes en 15% polyayrilamid gel mellem 0,8 millimeter adskilte glasplader i en plast støbt og indsætte en kam.

Når gelen er størknet, tilsættes 0,5 5X TBE til tanken og pipette kraftigt for at vaske brøndene af resterende urinstof. Efter forløb af polyakrylamidgelen i 25 minutter ved 375 volt, og prøverne efterlades mindst én vognbane mellem hver prøve. Læg 20 mikroliter af mindst to sæt markører i et asymmetrisk mønster for at holde styr på gelens retning og køre gelen ved en konstant 375 volt.

Efter 15 minutter, stige til en konstant 425 volt for resten af kørslen og køre gelen i omkring to timer. I slutningen af kørslen skal du bruge en pladeseparator til at fjerne gelen fra glaspladerne og placere gelen på en plastiksidebeskytter. Fortynde fem mikroliter af ethidiumbromid i 500 mikroliter destilleret vand og tilsæt farvestoffet på markørbanerne lige over den øverste lyseblå markør.

Brug derefter et rent barberblad til at skære gelerne fra den øverste til nederste markør i hver vognbane under ultraviolet lys og overføre stykkerne til en fire gange fire centimeter kvadrat af laboratorieforseglingsfilm. Skær gelen med omkring tre snit vandret og to snit lodret for at producere 12 små firkanter. Der tilsættes 400 mikroliter 0,3 molarnatriumchlorid på tætningsfilmen, og gelstykkerne guides i 1,5 milliliterssikoniumsrør.

Agitere prøverne på en møtrikker ved fire grader Celsius natten over. Næste morgen overføres 400 mikroliter af hver supernatant til nye rør. Der tilsættes en milliliter 100 % ethanol og en mikroliter på 15 mg/ml glykogen medfedtningsmiddel pr. rør.

Derefter opbevares rørene på minus 80 grader Celsius i en time. For fem prime linker ligation, først dreje ned optøede prøver og resuspend pellets i vand. Dernæst tilsættes 0,5 mikroliter af 100 mikromolar fem prime linker, en mikroliter T4RNA ligase buffer, en mikroliter på 10 millimolar ATP og en mikroliter polyethylenglycol til hver prøve.

Varm reaktionerne ved 90 grader Celsius i 30 sekunder, før de anbringes på is. Derefter tilsættes en mikroliter af T4RNA ligase en til hvert rør og inkubere reaktionerne ved stuetemperatur i to timer. Ved omvendt transskription indsamles prøverne ved centrifugering og opsuspendere den lufttørrede pellet i 8,25 mikroliter kernefrit vand.

Tilføj 0,5 mikroliter af 100 micromolar omvendt transskription primer og fem mikroliter af 2X omvendt transskription reaktion mix fra en supplerende DNA syntese kit. Efter tre minutter ved 42 grader Celsius, tilsæt 1,5 mikroliter af 10X omvendt transskriptionsenzym til hver prøve for en 30 minutters inkubation ved 42 grader Celsius i en termocykler. Efter neutralisering, forberede en PCR-reaktion med 29,5 mikroliter vand, fem mikroliter 10X taq buffer, en mikroliter nukleosid triphosphat, to mikroliter af 25 mikromolar frem primer, to mikroliter af 25 mikromolar omvendt primer, 0,5 mikroliter taq polymerase, og 10 mikrolitere af den omvendte transskriberet DNA.

Kør derefter to PCR-reaktioner. For agarose gel rensning, forberede en 4% agarose gel med lav smeltning agarose og belastning 40 mikroliter eller mere af PCR produkt på gelen med lastning farvestof og 100 base par og 25 base par størrelse markører. Efter at have kørt gelen, skæres båndet over 125 base par bånd og bruge en gel ekstraktion kit i henhold til producentens anvisninger.

Ryst for at opløse gelbåndet i buffer ved stuetemperatur, før det relevante udstyr anvendes til at kvantificere det endelige sekvensbibliotek. Brug derefter de relevante opensource bioinformatikværktøjer til at analysere sekvensdataene. I denne repræsentative PCR-reaktion på lavsmeltet agarosegel kan der observeres erhvervelse af det korrekte klonede produkt sammenlignet med det opnåede linkerlinkerprodukt og umættede kontra mættede prøver.

Efter justering til humane microRNA hårnåle, en stærk konkordans mellem microRNA læse tæller i hver replikat kan observeres. I alt 306 mikroRNA-arter blev påvist med det største antal læserkortlægning til microRNA 122. Det er vigtigt at huske at skære gelerne i den rigtige størrelse for at muliggøre en nøjagtig genopretning af mikroRNA’erne.

Efter sekventering af microRNAs, kan brugerne anvende en bioinformatik analyse til at karakterisere fordelingen af microRNAs inden for deres væv af interesse. Denne teknik er blevet brugt til at identificere, hvordan microRNAs behandles, og hvilke sæt mikroRNA’er ændres i visse kræftformer. Sørg for at udvise forsigtighed, når du håndterer ethidiumbromid, og når man ser på gelerne under ultraviolet lys.