http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/sv/59901

En komplett pipeline för att isolera och sekvensera mikroRNAs, och analysera dem med hjälp av Open source-verktyg

Vi har utvecklat ett definierat, reproducerbart och långvarigt protokoll för små RNA-sekvensering och för att analysera normaliserade läsningar med hjälp av opensource bioinformatikverktyg. De största fördelarna med vår strategi är att den exakt samlar in mikroRNA genom gelrening och att bioinformatikanalysen kan tillämpas oavsett hur mikroRNA samlas in. Hög genomströmning sekvensering av microRNAs kan avslöja insikt i sjukdomar mekanismer, bearbetning av microRNAs, och korrekt kvantifiering av genterapi metoder som levererar små RNAs.

Se till att arbeta i en RNase fri miljö och att hålla alla RNA produkter på is under hela förfarandet. Visualisera gel skärande steg kommer att hjälpa tittarna att identifiera rätt storlek på de produkter som krävs för nedströms applikationer. För tre främsta adaptor liger, kombinera 11 mikroliter av RNA med 1,5 mikroliter av ATP fri 10X T4RNA ligase reaktion buffert, en mikroliter av polyetylenglykol, och 0,5 mikroliter av tre främsta länkare.

Värm proverna vid 95 grader Celsius på en termocyklare i 30 till 40 sekunder, följt av kylning på is i en minut. Tillsätt en mikroliter T4RNA ligase två och inkubera reaktionen i rumstemperatur i två timmar. Medan proverna inkuberar, häll en 15%polyacyrilamid gel mellan 0,8 millimeter separerade glasplattor i en plast gjuten och sätt in en kam.

När gelen har stelnat, tillsätt 0,5 5X TBE till tanken och pipetteras kraftigt för att tvätta brunnarna i kvarvarande urea. Efter att förkört polyakrylamidgelen i 25 minuter vid 375 volt, ladda proverna som lämnar minst ett körfält mellan varje prov. Ladda 20 mikroliter av minst två uppsättningar markörer i ett asymmetriskt mönster för att hålla reda på gelorienteringen och kör gelen vid en konstant 375 volt.

Efter 15 minuter, öka till en konstant 425 volt för resten av körningen och kör gelen i cirka två timmar. I slutet av körningen, använd en plåtavskiljare för att ta bort gelén från glasplattorna och placera gelen på ett sidaskydd av plast. Späd fem mikroliter ethidiumbromid i 500 mikroliter av destillerat vatten och tillsätt färgämnet på markörbanorna strax ovanför den övre ljusblå markören.

Därefter använder du ett rent rakblad för att skära gelerna från den övre till nedre markören i varje körfält under ultraviolett ljus och överföra bitarna till en fyra med fyra centimeter kvadrat av laboratoriets tätningsfilm. Skär gelen med cirka tre snitt horisontellt och två snitt vertikalt för att producera 12 små rutor. Tillsätt 400 mikroliter 0,3 molar natriumklorid på tätningsfilmen och styr gelbitarna i 1,5 milliliter siliconized rör.

Agitera proverna på en mutter vid fyra grader Celsius över natten. Nästa morgon, överför 400 mikroliter av varje supernatant till nya rör. Tillsätt en milliliter av 100%etanol och en mikroliter av 15 milligram per milliliter glykogen co-precipitant per rör.

Förvara sedan rören på minus 80 grader Celsius i en timme. För fem främsta länkare liger, först snurra ner de tinade proverna och resuspend pellets i vatten. Därefter lägger du till 0,5 mikroliter av 100 mikromolar fem främsta länkare, en mikroliter av T4RNA ligase buffert, en mikroliter på 10 millimolar ATP och en mikroliter av polyetylenglykol till varje prov.

Värm reaktionerna vid 90 grader Celsius i 30 sekunder innan du placerar dem på is. Tillsätt sedan en mikroliter T4RNA ligase en till varje rör och inkubera reaktionerna i rumstemperatur i två timmar. För omvänd transkription, samla in proverna genom centrifugeringen och resuspend luften torkade pelleten i 8,25 mikroliter av nukleas fritt vatten.

Lägg till 0,5 mikroliter av 100 mikromolar omvänd transkriptas primer och fem mikroliter av 2X omvänd transkriptas reaktion mix från en kompletterande DNA-syntes kit. Efter tre minuter vid 42 grader Celsius, tillsätt 1,5 mikroliter av 10X omvänd transkriptas enzym till varje prov för en 30 minuters inkubation vid 42 grader Celsius i en thermocycler. Efter neutralisering, förbereda en PCR-reaktion med 29,5 mikroliter vatten, fem mikroliter av 10X taq buffert, en mikroliter av nukleosidtrifosfat, två mikroliter av 25 mikromolar framåt primer, två mikroliter av 25 mikromolar omvänd primer, 0,5 mikroliter av taq polymeras och 10 mikroliter av omvänd transkriberas kompletterande DNA.

Kör sedan två PCR reaktioner. För agarosgelrening, preparera en 4%agarosgel med låg smältningsagarn och ladda 40 mikroliter eller mer av PCR-produkten på gelen med lastningsfärgämne och 100 baspar och 25 basparstorleksmarkörer. När du har kört gelen, skär bandet ovanför 125 basparbandet och använd en sats för gelutvinning enligt tillverkarens anvisningar.

Skaka för att lösa upp gelbandet i buffert vid rumstemperatur innan lämplig utrustning används för att kvantifiera det slutliga sekvensbiblioteket. Använd sedan lämpliga opensource bioinformatik verktyg för att analysera sekvensdata. I denna representativa PCR-reaktion på lågsmälta agarosgel kan man observera förvärvet av den korrekta klonade produkten jämfört med den erhållna linker-linkerprodukten och omättade kontra mättade prover.

Efter anpassning till mänskliga microRNA hårnålar, en stark konkordans mellan microRNA läsa räknas i varje replikat kan observeras. Totalt 306 mikroRNA arter upptäcktes med det största antalet läsningar kartläggning till microRNA 122. Det är viktigt att komma ihåg att skära gelerna i lämplig storlek för att möjliggöra en korrekt återhämtning av microRNAs.

Efter sekvensering av microRNAs, användare kan tillämpa en bioinformatik analys för att karakterisera fördelningen av microRNAs inom deras vävnader av intresse. Denna teknik har använts för att identifiera hur mikroRNA bearbetas och vilka uppsättningar av microRNAs ändras i vissa cancerformer. Var noga med att utöva omsorg vid hantering av ethidiumbromiden och när du tittar på gelerna under ultraviolett ljus.