Summary
Här beskriver vi en steg-för-steg-strategi för att isolera små RNAs, berika microRNAs och förbereda prover för sekvensering med höga dataflöden. Sedan beskriver vi hur du bearbetar sekvensläsningar och anpassar dem till microRNAs med hjälp av verktyg med öppen källkod.
Abstract
Hälften av alla mänskliga transkriptioner tros regleras av microRNAs. Därför kan kvantifierande mikroRNA uttryck avslöja bakomliggande mekanismer i sjukdomstillstånd och ge terapeutiska mål och biomarkörer. Här specificerar vi hur man exakt kvantifierar mikroRNAs. Kortfattat, denna metod beskriver isolera mikroRNAs, ligating dem till adaptrar som lämpar sig för hög dataflöde sekvensering, förstärkning av slutprodukterna, och förbereda ett prov bibliotek. Sedan förklarar vi hur man justerar de erhållna sekvenseringen läsningar till mikroRNA hårnålar, och kvantifiera, normalisera, och beräkna deras differential uttryck. Mångsidig och robust, detta kombinerade experimentella arbetsflöde och bioinformatiska analys gör det möjligt för användare att börja med vävnads extraktion och avsluta med mikroRNA kvantifiering.
Introduction
Först upptäcktes i 19931, är det nu uppskattas att nästan 2000 mikroRNAs finns i den mänskliga arvsmassan2. MicroRNAs är små icke-kodning RNAs som typiskt 21-24 nukleotider lång. De är post-transkriptionella regulatorer av genuttryck, ofta bindande för kompletterande platser i 3-icke översatt region (3-UTR) av målgener att förtrycka proteinuttryck och försämra mRNA. Kvantifiering av mikroRNAs kan ge värdefull insikt i genuttryck och flera protokoll har utvecklats för detta ändamål3.
Vi har utvecklat en definierad, reproducerbar och lång-stående protokoll för små RNA sekvensering, och för att analysera normaliserade läsningar med öppen källkod bioinformatik verktyg. Viktigt, vårt protokoll möjliggör samtidig identifiering av både endogena mikroRNAs och exogent levererade konstruktioner som producerar mikroRNA-liknande arter, samtidigt som man minimerar läsningar som mappas till andra små RNA-arter, inklusive ribosomal RNAs ( rRNAs), överföra RNA-härledda små RNAs (tsRNAs), upprepade små RNAs-och mRNA-nedbrytningsprodukter. Som tur är är microRNAs 5-fosforylerade och 2-3 hydroxylerade4, en funktion som kan utnyttjas för att separera dem från dessa andra små rnas-och mRNA-nedbrytningsprodukter. Flera kommersiella alternativ finns för mikroRNA kloning och sekvensering som ofta är snabbare och enklare att multiplex; men den egenutvecklade karaktären av kit reagens och deras frekventa ändringar gör att jämföra prov körningar utmanande. Vår strategi optimerar insamlingen av endast den korrekta storleken av microRNAs genom akrylamid och agaros gel reningssteg. I detta protokoll beskriver vi också en procedur för att justera sekvensläsningar till microRNAs med hjälp av Open source-verktyg. Denna uppsättning instruktioner kommer att vara särskilt användbart för nybörjare informatikanvändare, oavsett om vårt bibliotek förberedelse metod eller en kommersiell metod används.
Detta protokoll har använts i flera publicerade studier. Till exempel, det användes för att identifiera mekanismen genom vilken Dicer enzymet klyver små hårnål RNAs på ett avstånd av två nukleotider från den inre slingan av stammen-loop struktur-den så kallade "loop-Counting regel"5. Vi följde också dessa metoder för att identifiera den relativa överflöd av levererade små hårnål RNAs (shRNA) uttryckt från rekombinanta Adeno-associerade virala vektorer (rAAVs), att identifiera tröskeln till shRNA uttryck som kan tolereras före levern toxicitet i samband med överskott shRNA uttryck6. Med hjälp av detta protokoll identifierade vi också mikroRNAs i levern som svarar på frånvaron av mikroRNA-122-en starkt uttryckt hepatisk mikroRNA-samtidigt som den karakteriserar nedbrytnings mönstret för denna microRNA7. Eftersom vi har använt vårt protokoll konsekvent i många experiment, har vi kunnat observera prov preparat i längsled, och se till att det inte finns några märkbara batcheffekter.
Genom att dela detta protokoll är vårt mål att göra det möjligt för användare att generera högkvalitativ, reproducerbar kvantifiering av mikroRNAs i praktiskt taget vilken vävnad eller cell linje som helst, med hjälp av prisvärd utrustning och reagenser och gratis bioinformatikverktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök bemyndigades av den institutionella djuromsorg-och bruk kommittén av universitetar av Washington.
Beredning av små RNA-bibliotek
1. RNA-isolering
- Isolera RNA från en biologisk källa med hjälp av en standard RNA-isoleringsreagens, eller ett kit som berikar för mikroRNAs. För vävnader är det bäst att börja med prover Snap-fryst i flytande kväve och marken till ett pulver med hjälp av en pre-kyld murbruk och mortelstöt.
- Mät varje provets RNA-integritet på ett instrument som kan kvantifiera RNA och ge ett RNA-integritetsnummer (RIN). RINs bör vara > 7.
2.3 ' adapterns ligering
- Förbered en ligeringsreaktion i PCR-bandrör, genom att kombinera: 11 μL RNA (1-3 μg, med samma mängd för varje prov), 1,5 μL av 10X T4 RNA-ligasreaktionsbuffert, ATP-fri, 1 μL Poly-etylenglykol (PEG) och 0,5 μL av 3 '-länkare (100 μM Universal miRNA kloning lin ker).
Anmärkning: frånvaron av ATP hjälper berika för miRNAs och minimerar kloning av mRNA nedbrytningsprodukter. PEG fungerar som ett molekylärt utträngning agent, förbättra framgångsrik ligering. Universal Mirna kloning länkare har en 3 ' blockerande grupp (amine) för att förhindra själv-ligering, circularization, och ligering till RNA vid 5 ' End. - Värm proverna vid 95 ° c på en termocyklern för 30-40 s. kyl på is i 1 min. Tillsätt 1 μl T4 RNA Ligase 2 och inkubera i rumstemperatur under 2 h. Förbered gelen (steg 2,3) medan proverna inkuberar.
Observera: inkubering vid rumstemperatur hjälper till att förhindra Linker-Linker ligering. Vi har också framgångsrikt använt T4 RNA Ligase 1. - Bered 30 mL av en 15% polyakrylamidgel med 8 M urea (för en 20x20 cm gel): 14,4 g urea, 3 mL 10X Tris-buffrad etylendiamintetraättiksyra (TBE), 11,2 mL 40% 19:1 akrylamid och H2O till 30 ml. Lösningen löses bäst vid 42 ° c. Tillsätt omedelbart före gjutning 150 μL av 10% ammoniumpersulfat (APS) och 30 μL tetrametylethylendiamamin (TEMED) för polymerisation.
- Häll mellan 0,8 mm separerade glasplattor i en plast gjuten och infoga kam. När gelen är stelnat (ca 20 min), tillsätt 0,5 x TBE till tank och tvätta brunnar av kvarvarande urea genom att Pipettera kraftigt.
- Pre-Run gelen vid en konstant 375 V för 25 min utan prover så urea kan komma in i gelen, tvätta sedan brunnarna igen.
Obs: mängden spänning kan behöva minskas beroende på vilken typ av strömförsörjning och elektrofores system som används. - När proverna är gjorda ligating, tillsätt 15 μL av den akrylamidbelastning som proverna (för ett 1:1-förhållande), och denaturera sedan 5 min vid 95 ° c på en ThermoCycler.
- Förbered 25 ng/μL av 37 och 44 BP storleks markörer, utspädd med en del akrylamid lastning färgämne. Sekvenser listas i tabell 1.
- Fyll på proverna på Polyakrylamidgelen och lämna minst ett körfält mellan varje prov. Fyll på 20 μL av minst två uppsättningar markörer i ett asymmetriskt mönster för att hålla koll på Gelens orientering.
- Kör gelen vid en konstant 375 V för de första 15 min och sedan öka till en konstant 425 V för den återstående körningen. Kör tills Bromofenolblåttlösning blå är ca 1-4 cm från botten, som tar cirka 2 h.
Obs: om det behövs kan gelen köras vid en lägre konstant spänning under en längre tid tills bromofenolblått är ca 1-4 cm från botten. - Ta bort gelen från glasplattorna med hjälp av en tallrik separator, och placera gelen på en plast sida beskyddare. Späd ut 5 μL etidiumbromid i 500 μL destillerat vatten och Pipettera till markör köer precis ovanför den övre ljusblå markören (se figur 1a).
FÖRSIKTIGHET: Använd handskar för etidiumbromid och kassera avfall i enlighet med lokala föreskrifter. Låt sitta i 5 min. - Under ultraviolett (UV) ljus, skär gelen från övre till undre markör i varje körfält med ren rakblad (se figur 1a). Överför till en 4 x 4 cm kvadrat med laboratorie tätning film, klipp sedan gelen med ca 4 snitt horisontellt och 3 vertikalt för att producera 12 små fyrkanter (se figur 1b).
- Pipettera över 400 μL av 0,3 M NaCl till tätnings film torget och tratt gel bitar i 1,5 mL silikoniserade rör (se figur 1c). Agitera proverna på en nutator vid 4 ° c över natten.
Anmärkning: andra låg-retention 1,5 mL rör kan ersättas för silikoniserade rör. - Efter minst 12 h agitation vid 4 ° c, Hämta proverna och Lägg dem på is, tillsammans med en konisk tub med 100% etanol.
- Överför 400 μL av supernatanten till ett nytt rör och tillsätt sedan 1 mL 100% etanol och 1 μL 15 mg/mL glykogen coprecipitant. Se till att samla så mycket supernatanten som möjligt, snurra ner vid 4 ° c och Pipettera mer vid behov. Placera vid-80 ° c i 1 h, eller-20 ° c i 2 h eller längre. Glykogen coprecipitant förbättrar pellets synlighet och återhämtning.
- Snurra vid 4 ° c vid 17 000 x g för 20-30 min. ta bort alla spår av etanol och låt pellets lufttorka i 5 min.
3.5 ' Linker ligering
- Återsuspendera pelleten genom att Pipettera i 6,5 μL av nukleasfritt vatten. Låta pelleten sitta i vatten i några minuter först kommer att hjälpa till med re-fjädring.
- Efter spinning ner pelleten och resuutgifterna i vatten, tillsätt 0,5 μL av 100 μM 5 '-länkare (med streckkoder, se tabell 1), 1 μl T4 RNA Ligase buffert, 1 μl 10 mm ATP, och 1 μl av PEG. Värm vid 90 ° c i 30 s och placera sedan på isen. Tillsätt 1 μL T4 RNA Ligase 1 och låt Inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar.
- Tillsätt 400 μL 0,3 M NaCl, följt av 400 μL syra fenol/kloroform. Vortex 30 s-1 min (lösningen kommer att se grumlig), och sedan snurra vid 4 ° c för 10-15 min vid max hastighet i en microcentrifug (~ 17 000 x g). Dra av det översta lagret och placera i nya 1,5 mL tub.
Obs: Undvik att Pipettera något av bottenskiktet. - Tillsätt 350 μL kloroform, skaka kort och snurra sedan vid 4 ° c i 10 min vid max hastighet (~ 17 000 x g). Dra av toppen senare och placera i nya 1,5 mL tub. Tillsätt 1,5 μL glykogencoprecipitant och 1 mL 100% etanol.
Obs: Undvik att Pipettera något av bottenskiktet. - Vortex kort, sedan placera vid-80 ° c i minst 1 h, eller-20 ° c över natten.
4. omvänd Transkription (RT)
- Slå på värmeblocket 42 ° c. Snurra proverna vid 4 ° c och ~ 17 000 x g för 20-30 min. ta bort alla supernatanten och låt pellets luften torka i 5 min.
- Återsuspendera pelleterat prov i 8,25 μL av Nuclease-fritt vatten, tillsätt sedan: 0,5 μL av 100 μM RT primer (tabell 1), och 5 μl 2X RT reaktionsblandning från en cDNA-syntes kit. Inkubera vid 42 ° c i 3 min.
- Tillsätt 1,5 μL av 10X RT-enzymet till varje prov och inkubera vid 42 ° c i 30 minuter i en ThermoCycler. Placera vid-20 ° c eller Fortsätt med hydrolys och neutralisering.
Obs: flera RT-Kit kan användas för steg 4,2 och 4,3. - Utför alkalisk hydrolys och neutralisering: gör 1 mL 150 mM kaliumhydroxid (KOH) lösning (150 μL av 1 M KOH, 20 μL av 1 M Tris bas pH 7,5, och 830 μL av H2O) och 1 ml 150 mm saltsyra (HCL) (150 μl av 1 m HCl och 850 μl av H2O).
- Innan du lägger till proverna, bestämma mängden HCl som behövs för att neutralisera KOH-lösningen. Generellt, cirka 20-24 μL av HCl kommer att neutralisera 25 μL av KOH. Kontrollera kombinationen på en pH-remsa för att säkerställa att den är i rätt område (pH 7,0 till 9,5).
- Hydrolysera proverna genom att tillsätta 25 μL 150 mM KOH-lösning och inkubera i 10 min vid 95 ° c.
- Neutralisera proverna genom att lägga till mängden 150 mM HCl bestämd i steg 4,4, för att erhålla ett slutligt prov pH mellan 7,0 och 9,5.
5. PCR-amplifiering
- Bered en PCR-reaktion efter neutraliseringen med: 29,5 μL vatten, 5 μL 10X Taq-buffert, 1 μL dNTP, 2 μL 25 μM framåtriktad primer (tabell 1), 2 μl 25 μm omvänd primer (tabell 1), 0,5 μl av Taq och 10 μl omvänt transkriberat cdna från steg 4,6 .
- Kör följande PCR-reaktion: 94 ° c i 2 min, sedan 20 cykler på 94 ° c för 45 s, 50 ° c för 75 s och 72 ° c för 60 s.
- Kör en andra PCR-reaktion på cirka 2-4 fler cykler med 5 μL produkt från steg 5,2. Blandning: 34,8 μL vatten, 5 μL 10X Taq-buffert, 1 μL dNTP, 1 μL 25 μM framåt primer (tabell 1), 1 μl 25 μm omvänd primer (tabell 1) och 0,2 μl av Taq-polymeras. Följ samma termocyklerparametrar som beskrivs i steg 5,2.
Anmärkning: Syftet med att göra två PCR-reaktioner-med den första för 20 cykler och den andra för bara 2-4 mer-är att se till att mängden cDNA förstärks är i ett dynamiskt omfång (dvs inte ett mättat belopp).
6. agaros gel rening
- Förbered en 4% aguppstod gel med låg-smältande aguppstod. Ladda 40 μL eller mer av PCR-produkten på gelen, tillsammans med laddnings färg. Ladda 100 BP och 25 BP storleks markörer.
Obs: den 25 BP stege hjälper till att skilja förstärks produkt från Linker-Linker ligering produkter. Låg-smältande agaros geler måste gjutas med större omsorg än traditionella agaros geler, så följ noga instruktionerna från tillverkaren. - För gel utvinning, Välj det cykel nummer som är synligt på gelen men inte är mättad (vanligtvis 22 – 24 cykler). Välj liknande intensitetsband när du kör flera exempel.
- Klipp bandet som ligger ovanför 125 BP-bandet (det mörkare bandet på 25 BP-stege; se figur 1d). Använd en gel Extraction Kit, följ tillverkarens instruktioner för att lägga buffert baserat på en 4% gel, skaka sedan för att lösa upp aguppstod i buffert vid rumstemperatur.
Anmärkning: upplösning vid 55 ° c ökar potentialen för länkare-Linker ligering. - Följ tillverkarens instruktioner för gel utvinning och eluera i 30 μL elueringbuffert eller vatten. Om produkten såg svag på gelen, sedan minska eluering till 20 μL.
- Mät cDNA-koncentrationen med en känslig teknik och Förbered prov bibliotek för sekvensering. Förberedelse kommer att bero på vilken typ av sekvensering som används.
Anmärkning: minimikrav för ett sekvenserings bibliotek är vanligtvis en 10 μL volym 10 μM produkt. Om koncentrationerna är för låga, pool och etanol fällnings prov för att föra bibliotek till önskad koncentration. - Sekvensera proverna med hjälp av tillgänglig utrustning. Ett vanligt exempel skulle vara att köra prover med hjälp av ett kit för 50 BP enda läsningar, för att få cirka 15-25 miljoner läsningar i en FASTQ utdataformat.
Liten RNA-sekvensjustering och bioinformatik
7. data överföring
- Hämta FASTQ-filer som genererats från varje sekvenserings körning. Ladda ner en lista på mikroRNA hårnål sekvenser från miRbase.org8,9,10.
- Generera ett Galaxy-konto på www.usegalaxy.org och ladda upp en FASTQ-fil med sekvens läsningar till detta konto.
- Ladda upp en textfil med streckkods serier till Galaxy-kontot, till exempel barcodes. txt, som finns som en textfil (tilläggstabell 1).
- Ladda upp en FASTA-fil av microRNA hårnålar till Galaxy-konto från en databas som miRBase.org. Exempel på mus (mousehairpins. FA) eller Human (humanhairpins. FA) microRNA-prekursorer finns i kompletterande tabell 2 och kompletterande tabell 3.
8. borttagning av adapter, streckkods sortering och trim
- I den vänstra fliken, navigera till Genomic fil manipulation > fasta/FASTQ ≫ Clip adapter sekvenser.
- I indatafilen i fasta eller fastq-format, ange fastq-fil från listrutan. Ändra minsta sekvenslängd till 18. Ändra källa för att ange anpassad sekvens. Ange Ctgtaggc. Behåll alla andra standardparametrar. Klicka på Kör.
Anmärkning: Sekvensläsningar som är kortare än 18 nukleotider är svåra att kartlägga unikt för mikroRNAs och innehåller många nedbrytningsprodukter. - I den vänstra fliken, navigera till Genomic fil manipulation > fasta/FASTQ ≫ streckkod splitter.
Obs: Galaxy funktioner och rubriker uppdateras regelbundet, så sökfunktionen kan vara nödvändigt att hitta ett likvärdigt verktyg eller dess plats. Kommersiella kit med indexerade primers är ofta redan sorteras efter streckkod. Därför är det här steget och streckkods trimnings steget inte nödvändigt om du startar från en kommersiell sats. - För streckkoder som ska användaspekar du på barcodes. txt. För bibliotek som ska delas, Använd Clip på data filen som producerats i föregående steg. Ange 1i antal tillåtna felmatchningar. Klicka på Kör.
- Trimma de första 4 nukleotider: navigera till text manipulationer ≫ trimma ledande eller avslutande tecken. För input dataset, klicka på mappikonen, som är en datamängds samling. Välj batchfilen med exempel, som innehåller etiketten barcode splitter på data. I trim från början upp till denna position, ange 5. I är input dataset i FASTQ-format? ange Ja. Klicka på Kör. Körningen kan ta flera minuter.
9. uppriktning av läsningar till mikroRNAs
- I Galaxy, navigera till Genomics analys > RNA-Seq ≫ Sailfish avskrift kvantifiering11.
- För frågan Välj en referens transkriptome från din historia eller använda ett inbyggt index? Välj Använd en från historiken. Ange den uppladdade filen mousehairpins. FA i listrutan. I FASTA/Q fil, klicka på mappikonen för att använda en datauppsättning samling och välj den fil som innehåller trim på samling. Klicka på Kör. Körningen kan ta flera minuter.
- I historikfliken till höger, klicka på Sailfish på Collection... som är en lista med 19 objekt. Klicka på varje enskild fil och klicka på diskikonen för att spara till den lokala datorn. Individuellt nedladdade filer måste först vara okomprimerade. De kan också behöva sparas igen med tillägget. txt i syfte att importera till ett kalkylblad.
- Öppna varje kalkylbladsfil i och omnamnge kolumnen Numreads till behandlings villkoret. Sammanfoga kolumnerna tillsammans för att generera en matris av mikroRNAs i den första kolumnen och läsa antal per villkor i efterföljande kolumner.
- För att beräkna differentialt uttryckt mikroRNAs för varje behandlings tillstånd, Använd filen med RAW microRNA Read räknas som indata för program som DESeq212. DESeq2 är närvarande i galaxen i genomik analys > RNA-seq ≫ DESeq2 fliken.
- Konvertera RAW-läsningar till normaliserade Läs värden för mikroRNA. Antalet är normaliserat till bibliotekens sekvensdjup i biblioteket genom följande beräkning: [(rå läsningar/totala mikroRNA läser) * (1 000 000 – antal mikroRNAs räknade) + 1].
ANMÄRKNINGAR: den här beräkningen ger en normaliserad läsningar per miljon (RPM) mappade mikroRNAs som kan jämföras mellan datauppsättningar och biologiska villkor. Utdata är en tabbavgränsad fil. Sailfish ger en TPM -utdatakolumn, även om detta värde är normaliserat av MicroRNA hårnål längd, vilket inte är nödvändigt i detta sammanhang. - Om det är relevant, upprepa justeringen med anpassade indatasekvenser (t. ex. en vektor) för att identifiera läsningar som mappas till levererade konstruktioner, som shRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schematiskt av steg involverade i biblioteks förberedelse
En övergripande Schematisk liten RNA-extraktion, sekvensering och justering beskrivs i figur 2.
Leverprover från en hane och en kvinnlig mus samlades in och snäpper fryst i flytande kväve. Totalt RNA extraherades och utvärderades för kvalitet och koncentration.
Liten RNA-sekvensering ger tillräckligt med RNA för sekvensering
3 μg RNA från två oberoende RNA-extraktioner användes som utgångsmaterial för små RNA-sekvensering. Proverna kördes på en akrylamidgel och klipptes ut mellanstorleks markörer motsvarande 17-28 NT RNA (figur 1a). Proverna hackades i fragment för RNA-isolering (figur 1b) och överfördes till ett lågkvarhållande 1,5 ml centrifugeringsrör (figur 1c). Streckkoderna bc7 och bc17 (tabell 1) var och ligaturer till 5 ' slutet av det lilla RNA. Små RNA-bibliotek var PCR förstärks med 22 cykler av PCR för att ge 8,0 och 11,2 ng/μl produkt, respektive. Proverna poolades och ett 10 nM poolade prov skickades för sekvensering med högt dataflöde med en Läs längd på 50 BP.
MiR-122 är den vanligast förekommande mikroRNA i mus levern
Efter streckkod sortering, 851 931 läsningar innehöll streckkoder från levern prov 1 och 650 154 från leverprov 2. Av de läsningar, 83,5% och 90,0% mappas till microRNAs respektive, med de återstående läsningar mappning till rRNAs (1,8% och 0,6% respektive), tRNAs och mRNA nedbrytning fragment. Efter anpassning till humana mikroRNA hårnålar, observerade vi stark överensstämmelse mellan mikroRNA läsa räknas i varje replikat (R2 = 0,998; Figur 3). Totalt upptäcktes 306 mikroRNA, med det största antalet läsningar som kartlades till miR-122 (kompletterande tabell 4). MicroRNA överflöd var likartad mellan manliga och kvinnliga leverprover.
Figur 1. Extraktion av små RNAs från en akrylamidgel. A) akrylamidgel och region som skärs med storleken på mikroRNAs. Bgel bitar före och efter styckning i mindre fragment. C) process för överföring av gelfragment till silikoniserade rör. DPCR-reaktion på låg smält Agros gel som visar korrekt klonade produkter jämfört med Linker-Linkers produkt och omättade (22 cykler) jämfört med mättade (24 cykler) prover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematiskt av protokoll. En tidslinje som visar de viktigaste stegen som ingår i förfarandet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Reproducerbarhet av resultaten från två oberoende RNA-extraktioner. Scatterplot av mikroRNA Läs räknas från en manlig mus lever (x-axeln) jämfört med en kvinnlig mus lever (y-axeln) med hjälp av en log10-baserad skala. Varje punkt representerar läsningar per miljon (RPM) kartlagda mikroRNA räknas för varje enskild mikroRNA. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primer | Sekvens | |
| 3 ' Linker 1 | rAppCTGTAGGCACCATCAAT – NH2 | |
| markör med lägre storlek | rArUrCrGrCrArUrGrCrUrGrArCrGrUrArCrUrArGGTAACCGCATCATGCGTC | |
| övre storleks markör | Rararurcrargrkgrarururgrcrarurgrararcrgrurarcrarurarggtaaccgcatcatgcgtc | |
| barcode1 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArGrCrG | |
| barcode2 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrGrUrC | |
| barcode3 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrUrGrG | |
| barcode4 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArCrUrU | |
| barcode5 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrGrGrU | |
| barcode6 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrUrA | |
| barcode7 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrArUrG | |
| barcode8 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrGrC | |
| barcode9 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrCrArG | |
| barcode10 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrArC | |
| barcode11 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrUrCrU | |
| barcode12 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrCrArArU | |
| barcode13 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArArGrA | |
| barcode14 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrArA | |
| barcode15 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrGrGrG | |
| barcode16 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrArUrUrG | |
| barcode17 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrUrCrArU | |
| barcode18 | /5AmMC6/ACGCTCTTCCGATCTrGrUrArU | |
| RT primer | ATTGATGGTGCCTACAG | |
| PCR-primer F | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |
| PCR-primer R | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG | |
Tabell 1. Lista över primers.
Kompletterande tabell 1. Lista över streckkods serier. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande tabell 2. Curated lista över mus mikroRNA föregångare sekvenser. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande tabell 3. Curated lista över mänskliga mikroRNA föregångare sekvenser. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande tabell 4. Rå och normaliserad mikroRNA läsa räknas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots identifieringen av mikroRNAs över 20 år sedan13, är processen med mikroRNA sekvensering fortfarande mödosam och kräver specialiserad utrustning, hindrar laboratorier från att rutinmässigt anta egna protokoll14. Andra tekniker kan samtidigt utvärdera microRNAs, som mikroRNA Microarrays och multiplexerade Expression paneler; dessa tillvägagångssätt är dock begränsade eftersom de endast kvantifierar de mikroRNAs som finns i deras sond uppsättning. På grund av detta missar de viktiga egenskaper hos små RNA-sekvensering, som identifiering av nya mikroRNAs, och av mikroRNA isoformer-nukleosidförändringar som kan ha viktig biologisk funktion6,7,15 .
När du startar ett nytt experiment är det ofta enklast att använda en kommersiell leverantör eftersom de erbjuder teknisk support och användarvänlighet. Flera kommersiella alternativ är tillgängliga för mikroRNA sekvensering, som kan multiplexeras för att minska arbetsbelastningen vid bearbetning av stora tal (> 100) av prover. Dessa kommersiella kit ständigt förbättras, vilket är både en fördel och nackdel. Å ena sidan, de företag som gör dessa kit har utvecklat nya microRNA fångstmetoder, till exempel genom circularization av deras 5 och 3 slutar före sekvensering eller använda degenererade Linkers med slumpmässiga sekvenser i varje ände för att minska ligering bias. De har också utvecklat metoder för att ta bort adapterdimers, till exempel genom ligering av dubbelsträngade adaptrar eller hybridisering av komplementära oligonukleotider. Å andra sidan, kommersiella kit rekommenderar mot modifiering eller ändring av något steg. Därför, om några uppdateringar görs till ett kit, är det svårt eller omöjligt att jämföra data som härrör från gamla och nya versioner av byggsatser, samt data som härrör från byggsatser från olika kommersiella leverantörer. Här har vi beskrivit ett protokoll som har kvar makten inför kommersiella alternativ. Vårt fokus på gel rening steg-samtidigt som de lägger tid till protokollet-möjliggör konsekvent microRNA fånga och reproducerbarhet under de många år som vi har använt den. Flera utvärderingar av reproducerbarheten mellan kommersiella kit och egna protokoll har gjorts, och vi hänvisar läsaren till några av dessa studier16,17,18,19. Viktigare är att de steg vi skisserar för bioinformatik analys av microRNAs kan användas oavsett valet av Kit eller in-House protokoll.
MikroRNA sekvensering besväras ofta av valet av streckkoder: i vissa fall kan ligationseffektiviteten hos de olika streckkoderna inte vara likvärdig, vilket leder till partiska distributioner av sekvenser i proverna20. Det är nu rekommenderat att använda degenererade baser vid 5-och 3-änden för att minimera ligeringsfördomar av specifika mikroRNAs21,22. I detta protokoll har vi inte observerat dessa ligationsfrågor och har observerat konsekventa avläsningar för tekniska och biologiska replikat utvärderade med olika streckkoder5,6,7,23, men det är viktigt att vara medveten om dem. Metoder för att undvika ligering bias inkluderar införlivandet av index primers i PCR primers, eller att lägga till en eller flera slumpmässiga RNA-nukleosider vid 3 slutet av 5 adapter sekvens (tabell 1). Att introducera en eller flera syntetiska spik-i-RNA, såsom C. elegans miR-39 MicroRNA24, är också ett alternativ för normaliserings ändamål, vilket är avgörande för situationer med låg avkastning, som att kvantifiera mikroRNAs från exosomes. Likaså, för RNA-ligering, vi har framgångsrikt använt T4 RNA Ligase 1, men ligering med mindre bias har visats för en stympad form av T4 RNA Ligase 225. Slutligen, Superscripts III och IV är alternativa omvänd Transkription enzymer som vi har använt utan problem.
Valet av microRNA-databas kan också påverka de slutliga normaliserade resultaten. En utmaning med kurerar MicroRNA databaser är att flera nya små rnas listade som mikroRNAs är faktiskt fragment av upprepa element och inte bona fide micrornas2. Ansträngningar har gjorts för att pensionera microRNAs som inte uppfyller standardkriterierna, så att nästa version av en microRNA-databas blir mer förfinad. nästa iteration innehåller dock även nya kandidater som behöver bekräftas. När mikroRNA med upprepad härledd ingår i anpassningar kan de skeva resultaten och överväldiga data från befintliga mikroRNAs. Därför är användningen av välkurerade datamängder av mikroRNAs från olika arter nödvändiga26,27. Vi har upplevt största reproducerbarhet vid anpassning av små RNA-sekvensering till curated listor över bevarade mikroRNAs och har inkluderat dessa hårnålar i kompletterande tabell 2 och kompletterande tabell 3. Dessa listor matchar uppskattningar av ca 500 hög tillförlitlighet mikroRNAs i människans arvsmassa2,26.
Som med alla tekniker, resultat bör bekräftas med en ortogonala tillvägagångssätt. Vi har framgångsrikt reproducerat små RNA sekvensering resultat med små RNA nordliga blotting som innehåller radiomärkade sonder för att bekräfta storleken och relativa överflöd av kandidat micrornas6,7,23. Kvantitativ PCR av mikroRNAs med Split-Read-sekvensering och bekräftelse av mRNA-ändringar med qPCR och Western blotting är andra alternativ för validering.
Sammanfattnings, har vi tillhandahållit en metod för att isolera och sekvensera mikroRNAs och utföra anpassningar mot befintliga microRNA-databaser. Överkomligheten för reagenser och utrustning och användningen av Open source-verktyg för analys bör göra detta protokoll tillgängligt för alla. Slutligen kan detta protokoll användas i någon vävnad eller cell linje för att ge mycket reproducerbara, högkvalitativa läsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka medlemmarna i laboratorierna för Andrew Fire och mark Kay för vägledning och förslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P.
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C.
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S.
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
