Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

Lattice lys-ark mikroskopi er en kraftfuld billedbehandling teknologi, men kun få laboratorier i verden er i stand til at bruge det. Denne protokol giver et detaljeret overblik over, hvordan du bruger det kommercielt tilgængelige gitters lysarkmikroskop. Det er et ekstremt kraftfuldt system i stand til fire-dimensionelle billeddannelse af individuelle celler eller embryoner, der giver mulighed for real-time sporing af molekyler.

Den største fordel ved denne teknik er, at det kan tre-dimensionelt billede enkelt levende celler eller organer med høj spatiotemporal opløsning og minimal foto blegning. Gittermønsteret i lysarket giver os mulighed for at højhastighedstog billedprøver og få real-time videoer af tre-dimensionelle levende celler og organer med molekylære detaljer, som andre teknikker ikke kan opnå. Denne første video protokol, der viser, hvordan vi gitter lys-ark mikroskopi til billedet enkelt celle firedimensionelt.

Dette er en meget kompliceret teknik på grund af tilpasning og prøve forberedelse. Og vi mener, at visuel demonstration vil forbedre tilgængeligheden ved at give flere forskere mulighed for at forestille sig mange forskellige molekyler, celler og organer i biologi. For at begynde denne procedure, inkubere fem millimeter runde coverslips med 0,1% poly-L-lysin ved stuetemperatur i 10 minutter.

Aspirate off væsken og lad coverslips lufttørre naturligt. Dernæst tilsættes tre milliliter tæthed gradient til en 15 milliliter konisk rør. Tilsæt forsigtigt celler drop-wise til kanten af røret.

Centrifuge ved 930 gange g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Derefter fjernes det tynde midterste lag af celler mellem det komplette medie og detsitetsgradient reagensen og sørg for at sætte hver celletype i et separat konisk rør. Centrifuge ved 300 gange g i fem minutter for at vaske cellerne.

Kassér supernatanten og tilsæt fem milliliter RPMI til rør af T-celler og CH27 celler. Vasken gentages med frisk RPMI, indtil der er udført tre vaske i alt. Derefter resuspenderede cellerne i hvert rør med en milliliter komplet RPMI og tælle cellerne med et hæmocytometer.

Resuspend en million antigen-præsentere celler i 500 mikroliter af komplet RPMI og tilsæt 10 mikromolar MCC. Inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i tre timer. Derefter opsender resuspend en million T-celler i 500 mikroliter af komplet RPMI.

Tilføj to mikrogram anti-TCR beta Alexa 488 mærket FAB og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 30 minutter. Dernæst centrifuge begge celler ved 300 gange g i fem minutter og kassér supernatanten. Tilsæt 500 mikroliter af komplet RPMI og gentag centrifugen for at vaske cellerne.

Vasken gentages med frisk RPMI, indtil der er udført tre vaske i alt, som kasseres supernatanten efter hver vask. Derefter skal begge celletyper resuspeneres i 500 mikroliter billedmedier. Først tilsættes 10 milliliter vand og 30 mikroliter fluorescein til LLSM badet.

Tryk på Image Home for at flytte objektet til billedposition og se på et enkelt Bessel-laserstrålemønster. Juster laserstrålen ved hjælp af styrestyret og det forudindstillede område af interesse for at gøre strålen til et tyndt mønster, der er afbalanceret i alle retninger. Strålen skal også vises fokuseret i finderen kameraet.

Brug de to spejl tilt justeringsankere, det øverste fokus mikrometer, og den objektive farve til at justere strålen. Dernæst vaske badet og målene med mindst 200 milliliter vand til helt at fjerne eventuelle fluorescein. Hvis du vil afbilde standardlysstofrør, skal du slå rastersimuleringsværktøjet til ved at indstille til tre i Xgalvo-områdeboksen og trykke på Live for at få vist det aktuelle felt.

Juster tiltspejlet, målfarven og fokusmikrometeret manuelt for de højeste grå værdier. Derefter justeres efter behov for at opnå korrekte mønstre for objektiv scanning, Z galvo, Z plus mål, og prøve scanning fange tilstande. Derefter skal du trykke på Execute in sample scan mode for at indsamle eksempelpunktsspredningsfunktionen til de-skævhed og de-convolution.

Skift lasere til tre farver, og tryk på Execute igen. Til at begynde, tilføje 100,000 anti-præsentere celler til den forberedte fem millimeter diameter cirkulære coverslip og give dem mulighed for at bosætte sig i 10 minutter. Smør prøveholderen og tilsæt dækslæd til den cellesiden op.

Tilføj derefter en dråbe billedmedier på bagsiden af dækslæbet. Skru prøveholderen på Piezo, og tryk på Image Home. Find en antigen-præsentationscelle til billede, og sørg for, at LLSM- og billedbehandlingssoftwaren fungerer korrekt.

Tryk på Live for at se det aktuelle billede. Flyt langs Z for at finde coverslip og celler. Find midten af en antigen-præsentationscelle ved at bevæge dig i Z-retningen, og tryk derefter på Stop for at sætte laseren på pause.

Kontroller 3D, og indtast de ønskede indstillinger. Tryk på Center, og tryk derefter på Udfør for at indsamle dataene. Sænk fasen til belastningspositionen, og tilsæt 50 mikroliter T-celler og billedmedier drop-wise direkte over dækslæbet.

Det er bedst at lade en dråbe form på enden af pipette spidsen og derefter røre spidsen til badet væske. Hæv scenen tilbage ved at klikke på Billede retur. Begynd billeddannelse.

Sørg for at indstille den ønskede Z-stak og timelapse-længde. For eksempel, billede 60 Z stakke på en 0,4 mikrometer trin størrelse og input 500 tidsrammer. Stop optagelsen før 500 billeder nås for at undgå foto blegning.

Brug live-tilstand til at søge efter cellepar, og når du er klar og ønsket indstillinger er indtastet, skal du trykke på Udfør for at indsamle data. I denne undersøgelse isoleres og fremstilles primære muse 5CC7 T-celler og afbildes derefter ved hjælp af et gitterslysarkmikroskop. Vist her er den korrekte stråle sti og stråle justering, når afbildet med fluorescein.

Den objektive scanning skal vise en stor X-form i XZ og YZ fremskrivninger, der er så symmetrisk som muligt. De bør også justeres til at være så lille af et X som muligt. Z galvo scanningen skal vise en oval i XZ og XY med en enkelt prik på hver side.

Endelig bør både Z plus objektive scanning og prøvescanningen vise prikker, der ser så runde som muligt. Ved hjælp af denne protokol kunne man se den firedimensionale dynamik i T-cellereceptorerne på en T-celleoverflade. Den største fordel ved dette mikroskop ligger i evnen til at spore de visualiserede overfladeenheder af T-celle receptorer og til at opnå kvantificerede data fra deres størrelse, bevægelse, signal intensitet, og ekskrementer.

Det vigtigste at huske er kvaliteten af din tilpasning. Gitterlysarket skal justeres dagligt og ikke gøre dette korrekt, vil resultere i forvrænget billeddannelse. På samme måde påvirker kvaliteten af den indsamlede psf direkte kvaliteten af de-convolution, hvilket i sidste ende resulterer i kvaliteten af dit endelige billede.

En af grundene til denne metode er så kraftfuld, er fordi hver celle og etiket kan erstattes for at visualisere mange celletyper og molekyler. Derfor kan denne metode bruges til at besvare ethvert spørgsmål relateret til fire-dimensionel sporing af molekyler. Vi mener, at denne teknik vil bane vejen for forskere til at udforske nye spørgsmål inden for molekylær handel.

Det er endnu ikke udbredt på grund af det komplicerede system, så vi håber, at denne Jove video vil forbedre tilgængeligheden til teknikken. De lasere, der anvendes på systemet er klasse fire, så absolut forsigtighed skal tages for at sikre laser sikkerhed. Tag den nødvendige lasersikkerhedstræning, før du bruger denne metode.