Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

Lattice ljus-ark mikroskopi är en kraftfull bildteknik, men få laboratorier i världen kan använda den. Detta protokoll ger en detaljerad översikt över hur man använder kommersiellt tillgängliga gitter light-sheet mikroskop. Det är ett extremt kraftfullt system som kan fyrdimensionell avbildning av enskilda celler eller embryon som möjliggör spårning i realtid av molekyler.

Den största fördelen med denna teknik är att det kan tredimensionellt bild enda levande celler eller organ med hög spatiotemporal upplösning och minimal foto blekning. Gittermönstret i ljusbladet gör det möjligt för oss att snabba bildprover och få videor i realtid av tredimensionella levande celler och organ med molekylära detaljer som andra tekniker inte kan uppnå. Denna första video protokoll som visar hur vi oss gitter ljus-ark mikroskopi till bild enda cell fyrdimensionellt.

Detta är en mycket komplicerad teknik på grund av anpassning och provberedning. Och vi tror att visuell demonstration kommer att förbättra tillgängligheten genom att tillåta fler forskare att avbilda många olika molekyler, celler och organ i biologi. För att påbörja detta förfarande, inkubera fem millimeter runda coverslips med 0,1%poly-L-lysin vid rumstemperatur i 10 minuter.

Aspirera av vätskan och låt täckskydden lufttorka naturligt. Därefter lägger du till tre milliliter densitetsgradient till ett 15 milliliter koniskt rör. Lägg försiktigt celler drop-wise till kanten av röret.

Centrifugera vid 930 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Efter detta försiktigt bort det tunna mellersta lagret av celler mellan den kompletta media och densitet gradient reagens se till att sätta varje celltyp i en separat konisk rör. Centrifugera vid 300 gånger g i fem minuter för att tvätta cellerna.

Kassera supernatanten och tillsätt fem milliliter RPMI till rören av T-celler och CH27 celler. Upprepa tvätten med färskt RPMI tills tre totaltvättar har utförts. Sedan, resuspend cellerna i varje rör med en milliliter av komplett RPMI och räkna cellerna med en hemocytometer.

Resuspend en miljon antigen-presentera celler i 500 microliters av komplett RPMI och lägga till 10 mikromolar MCC. Inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i tre timmar. Efter detta, resuspend en miljon T-celler i 500 microliters av komplett RPMI.

Tillsätt två mikrogram anti-TCR beta Alexa 488 märkt FAB och inkubera i 37 grader Celsius med 5%koldioxid i 30 minuter. Därefter centrifug båda cellerna vid 300 gånger g i fem minuter och kassera supernatanten. Tillsätt 500 mikroliter av komplett RPMI och upprepa centrifug för att tvätta cellerna.

Upprepa tvätten med färskt RPMI tills tre totala tvättar har utförts kasta supernatanten efter varje tvätt. Efter detta, resuspend båda celltyperna i 500 microliters av bildbehandlingsmedia. Tillsätt först 10 milliliter vatten och 30 mikroliter fluorescein till LLSM-badet.

Tryck på Image Home för att flytta objektet till bildposition och titta på ett enda Bessel laserstrålemönster. Rikta in laserstrålen med hjälp av guide och förinställd region av intresse för att göra strålen till ett tunt mönster som är balanserat i alla riktningar. Strålen ska också visas fokuserad i finder kameran.

Använd de två spegellutningsjusterarna, den övre fokus mikrometern, och den objektiva färgen för att justera strålen. Därefter tvätta badet och målen med minst 200 milliliter vatten för att helt ta bort eventuella fluorescein. Om du vill avbilda standardfluorescerande pärlor aktiverar du gitter genom att ställa in till tre i rutan Xgalvo-intervall och tryck på Live för att visa aktuellt fält.

Justera lutningsspegeln, objektiv färg och fokus mikrometer manuellt för högsta gråvärden. Justera sedan vid behov för att erhålla ordentliga mönster för objektiv skanning, Z galvo, Z plus objektiva och provskanningsavsökningslägen. Efter detta trycker du på Utför i provgenomsökningsläget för att samla provpunktsspridningsfunktionen för de-skevning och de-convolution.

Ändra lasrarna till tre färgläge och tryck på Utför igen. Till att börja, tillsätt 100, 000 anti-presentera celler till den förberedda fem millimeter diameter cirkulära coverslip och låta dem nöja sig med 10 minuter. Smörj provhållaren och tillsätt täckskydd till den cellsidan uppåt.

Lägg sedan till en droppe bildmedia på baksidan av täcket. Skruva fast provhållaren på Piezo och tryck på Image Home. Hitta en antigenpresenterande cell till bild och se till att LLSM och bildhanteringsprogram fungerar korrekt.

Tryck på Live för att visa den aktuella bilden. Flytta längs Z för att hitta coverslip och celler. Hitta mitten av en antigenpresenteringscell genom att röra sig i Z-riktningen och tryck sedan på Stopp för att pausa lasern.

Kontrollera 3D och mata in önskade inställningar. Tryck på Center och tryck sedan på Utför för att samla in data. Sänk scenen till lastpositionen och tillsätt 50 mikroliter av T-celler och bildhanteringsmedia droppvis direkt över täcket.

Det är bäst att låta en droppe form på slutet av pipetten spets och sedan röra spetsen till badet vätska. Höj scenen bakåt genom att klicka på Bildretur. Påbörja bildbehandling.

Var noga med att ställa in önskad Z stack och timelapse längd. Till exempel bild 60 Z stackar vid en 0,4 mikrometer steg storlek och ingång 500 tidsramar. Stoppinspelning innan 500 bildrutor nås för att undvika fotoblekning.

Använd live-läge för att söka efter cellpar och när redo och önskade inställningar har skrivits in, tryck på Utför för att samla in data. I denna studie, primära mus 5CC7 T-celler är isolerade och beredda och sedan avbildas med hjälp av ett gitter ljus-ark mikroskop. Visas här är rätt strålbana och stråljustering när den avbildas med fluorescein.

Målsökningen ska visa en stor X-form i XZ- och YZ-projektionerna som är så symmetrisk som möjligt. De bör också justeras så att de är så små som möjligt av ett X. Z galvo-skanningen ska visa en oval i XZ och XY med en enda punkt på vardera sidan.

Slutligen bör både Z plus objektiv skanning och provskanning visa punkter som ser så runda som möjligt. Med hjälp av detta protokoll, den fyrdimensionella dynamiken i T-cellsreceptorer på en T-cell yta kunde ses. Den största fördelen med detta mikroskop ligger i förmågan att spåra de visualiserade ytenheterna hos T-cellsreceptorerna och att få kvantifierade data från deras storlek, rörelse, signalintensitet och utsöndring.

Det viktigaste att komma ihåg är kvaliteten på din anpassning. Gittern ljusbladet måste vara inriktade dagligen och inte göra detta på rätt sätt kommer att resultera i förvrängd bildbehandling. På samma sätt påverkar kvaliteten på polyesterstapel polyesterstapeln som samlas in direkt kvaliteten på de-faltningen vilket i slutändan resulterar i kvaliteten på din slutliga bild.

En av anledningarna till denna metod är så kraftfull är att varje cell och etikett kan ersättas för att visualisera många celltyper och molekyler. Därför kan denna metod användas för att svara på alla frågor som rör fyrdimensionell spårning av molekyler. Vi tror att denna teknik kommer att bana väg för forskare att utforska nya frågor inom området för molekylär handel.

Det är ännu inte används i stor utsträckning på grund av det komplicerade systemet så vi hoppas att denna Jove video kommer att förbättra tillgängligheten till tekniken. De lasrar som används på systemet är klass fyra så absolut försiktighet måste vidtas för att säkerställa lasersäkerhet. Vänligen ta nödvändig lasersäkerhetsutbildning innan du använder denna metod.