Developmental Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Serum fri produktion av tredimensionella humana Hepatosfärer från pluripotenta stamceller
Summary July 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll beskriver en metod för att producera hepatospheres från humana pluripotenta stamceller med hjälp av ett definierat kultur system och cell Self-församling. Detta protokoll är reproducerbara i ett antal cellinjer, kostnadseffektiv och tillåter produktion av stabila mänskliga hepatospheres för biomedicinsk tillämpning.
Transcript
Denna methogenetics stor mängd 3D hepatospheres av mänskliga pluripotenta stamceller med hjälp av fina material och celler av montering. Det viktigaste förskottet av denna teknik är att det tillåter att kontrollera storleken på 3D lever sfärerna, begränsa bildandet av nekrotiska centra och förlust av fenotyp. Demonstrerar proceduren med mig blir Yu Wang, en postdoktor i vårt laboratorium.
Förbered dig på att presentera agarose formar genom att lösa upp två gram lågsmälttemperatur uppstod i 100 milliliter steriliserat destillerat vatten. Värm försiktigt blandningen i mikrovågsugnen med intervallskakning för att lösa upp agarosen helt. Tillsätt 520 mikroliter av den smälta agaros till en 256 välformat mögel och låt den stelna.
Överför sedan varje agarros mikroplatta till en enda brunn av en 12-brunnsplatta. Tillsätt 1,5 milliliter DPBS med kalcium och magnesium till varje brunn och pipettera upp och ner för att ta bort bubblor. För att förbereda cellupphängningen, börja med att aspirera mediet från en odifferentierad kultur av mänskliga pluripotenta stamceller, eller HPSC.
Skölj cellerna genom att lägga till fem milliliter av rumstemperatur DPBS, kalcium eller magnesium gratis och ta sedan bort bufferten. Tillsätt fem milliliter cell dissociation reagens till cellerna och inkubera vid 37 grader Celsius i sex till åtta minuter. Observera cellavlossning under mikroskop och förläng inkubationen ytterligare en eller två minuter om så krävs.
Stoppa reaktionen genom att ta bort cellen dissociation reagens och lägga till fem milliliter av färska MT tjäna ett medium kompletteras med 10 mikromolar berghämmare, Y27632. Pipett upp och ner flera gånger för att separera celler. Räkna de livskraftiga cellerna med hemocytometern och trypan blå färgning för att beräkna det totala antalet celler som behövs.
Överför önskat antal celler till ett sterilt centrifugrör på 15 eller 50 milliliter och centrifug vid 200 gånger G i fem minuter för att pelleta cellerna. Kassera supernatanten och åter upphäva cellerna i MT tjäna ett medium med 10 mikromolar berghämmare för en slutlig koncentration av 2,1 miljoner celler per milliliter. Därefter spara cellerna genom att lägga till 190 mikroliter av beredd cell suspension per agaros mikro brunn och inkubera agaros mikroplattorna vid 37 grader Celsius i fem procent koldioxid i två timmar.
Efter inkubationen, tillsätt en milliliter färsk, varm, T-servera ett medium med bergshämmare till varje brunn. Lämna tillbaka plattorna till inkubatorn och lämna dem där i 24 timmar. På nästa dag, undersöka sfären av formation.
Förbered poly-två hydroxyetylmetakrylat eller poly-hemabelagda brunnar genom att lösa upp två gram poly-hema i 100 milliliter 95%etanol och rör om lösningen över natten på en 55 grader Celsius värmeplatta. På nästa dag, tillsätt 250 mikroliter av lösningen till varje brunn av en 24-brunnsplatta och torka plattan över natten i en 60 grader Celsius ugn. Initiera hepatoc differentiering genom att försiktigt ta bort MT serven ett medium från de tidigare seedade cellerna och ersätta den med en milliliter av färskt endoderm differentieringsmedium.
För mänskliga embryonala stamceller, uppdatera medium var 24 timmar i tre dagar. Det är viktigt att inleda hepatocyte differentiering 24 timmar post-seeding att undvika spontan cell differentiering. Efter definitiv endoderminduktion, växla mediet till hepatoblast differentieringsmedium i fem dagar.
Byt ut mediet varannan dag, utför den sista ändringen på den sista dagen av hepatoblast specifikation. För att överföra hepatosfärerna till de förberedda poly-hemabelagda brunnarna, tvätta cellerna med hepatocytets mognadsmedium och tillsätt sedan en milliliter av mediet kompletterat med 10 nanogram per milliliter HGF och 20 nanogram per milliliter OSM. Pipettera lösningen upp och ner flera gånger för att lyfta hepatosfärerna från agaros mikroplattan och överföra dem till en poly-hemabelagd brunn.
Tvätta agarosmikroplattan med en milliliter av det kompletterade hepatocytemognadsmediet och överför mediet till poly-hemabelagd brunn. Med hjälp av en P-100 pipetter, försiktigt aspirera överskott medium utan att ta bort hepatosfärer tills det finns ungefär en milliliter medium kvar i brunnen. Uppdatera mediet var 48:e timme i 12 dagar.
Om du arbetar med embryonala stamceller, växla mediet till hepatocyt underhållsmedium vid dag 20 genom att ta bort mognadsmediet, tvätta cellerna med underhållsmedium, och sedan lägga till en milliliter kompletterat underhållsmedium. Efter detta, uppdatera medium var 48 timmar. Omedelbara förändringar måste utföras noggrant för att undvika allvarlig stress och förvrängning av denna sfäriska struktur.
Färgning för hepatocyte i mesenkymala markörer frossar att hepatospheres bildas med hjälp av denna teknik är sammansatt av hepatocyte-liknande celler som omger en kärna av mesenkymala celler. Andra proteiner som typiskt uttrycks i hepatocyter finns också på det yttre lagret av sfärerna. Funktionell analys av cytokrom P450 enzymer eller CYP i 30 dagars hepatosfär kulturer visade att 3D-sfärerna visar respektabla nivåer av CYP aktivitet jämfört med mänskliga primära hepatocyter.
Vidare kan det påvisas att hepatosfärerna utsöndrar leverproteiner som Albumin och alfa-fetoprotein. Det viktigaste att komma ihåg för detta protokoll är att försiktigt pipettera upp och ner lösningen som innehåller 3D-hepatosfärer när de överförs till poly-hema belagda plattan. Detta hjälper till att undvika att skada dem.
När behärskar, denna metod tillåter generering av 3D lever sfärer som förblir funktionella under ett år in-vitro med flera tillämpningar i avliden modellering och drog screening. Framöver kan denna teknik användas som en plattform för att utveckla ytterligare entodermala och mesenkymala vävnader med komplexa arkitekturer.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
