Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر
Chapters
Summary October 8th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
نقدم هنا البروتوكول الذي يمكن تصوره قبل و/أو الكالسيوم بعد المتشابك في سياق التعلم والذاكرة دروفيفيا . في صور الكالسيوم المجرية باستخدام حساسات الكالسيوم المترجمة بالمشبك يتم الجمع بينها وبين النموذج الكلاسيكي لتكييف حاسة الشم بحيث يمكن تحديد اللدونة المتشابكة الكامنة وراء هذا النوع من التعلم النقابي.
Transcript
هذه التقنية يسهل الملاحظة في الوقت الحقيقي من نشاط الكالسيوم متشابك كمعلمة فسيولوجية للعمليات الخلوية الكامنة تحت التعلم وتكوين الذاكرة في drosophila الميلانوغاستر. من خلال مقارنة استجابات الخلايا العصبية للروائح قبل وبعد التدريب النقابي ، يمكننا رسم روابط مباشرة بين النشاط المتشابك وتشكيل تتبع الذاكرة في ذباب الفاكهة الفردي. لإنتاج ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا التي الخلايا العصبية المحددة من الفائدة التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا عبر الإناث عذراء والذكور الذباب تحمل GAL4 المطلوب و UAS يبني، وعمر ذرية الإناث حتى ثلاثة إلى ستة أيام بعد eclosion.
لإعداد ذبابة للتصوير ، استخدم ملقطًا جيدًا لوضع ذبابة مُجَبَّنة في غرفة تصوير مخصصة. باستخدام مجهر تشريح لوضع الصدر والساقين في اتصال مع الأسلاك الكهربائية في الجزء السفلي من الغرفة، ومع الرأس ملقاة شقة. إصلاح ذبابة في مكان مع شريط لاصق واضح، واستخدام شفرة مشرط الجراحية لقطع نافذة في الشريط حول الرأس، وترك الهوائي مغطاة وفقط الجزء الأمامي معظم الصدر المكشوفة.
استخدام دبوس حشرة التي عقدت من قبل الفكين مقعر محدب لإحاطة بعناية الجانبين والظهر من الرأس مع الضوء الأزرق علاج الغراء. واستخدام الضوء الأزرق الباعثة مصباح LED لضبط الغراء. عندما يتم ضبط الغراء تمامًا ، قم بمسح أي غراء غير مُتَرَق من السطح الظهري لرأس الذبابة وغطّي بشرة الرأس المكشوفة مع قطرة من محلول Ringer.
باستخدام سكين طعنة مشفرة جدا، وقطع من خلال بشرة عبر الجزء الخلفي من الرأس، بدءا من ocelli وقطع كل ميديل الجانب إلى العينين لتشكيل رفرف من بشرة التي يمكن أن تمزق بسهولة باستخدام ملقط. إزالة أي بشرة الزائدة التي قد تمنع منطقة الدماغ من الفائدة واستخدام ملقط غرامة لمسح بعناية سطح الظهر من أي القصبة الهوائية، مع الحرص على تجنب اضطراب أنسجة الدماغ نفسها. إزالة وتحديث الحل Ringer 'ق حسب الضرورة لمسح المنطقة من الحطام الأنسجة.
ووضع حقنة تحت الجلد تسليم إبرة ما يقرب من سنتيمتر واحد من رأس الذبابة، مع الحرص لا يوجد شيء يمكن أن تعوق تسليم رائحة إلى الهوائي. ثم قم بتوصيل غرفة التصوير بنظام توصيل الرائحة عبر إبرة توصيل الرائحة تحت الجلد. وتسمح للذبابة 10 دقائق للتعافي من التخدير والجراحة.
للتصور من مؤشرات الكالسيوم GFP القائمة، ضبط ليزر من مجهر متعدد الفوتون مجهزة ليزر الأشعة تحت الحمراء وهدف الغمر المياه المثبتة على جدول اهتزاز معزولة إلى الطول الموجي إثارة من 920 نانومتر وتثبيت مرشح شريط النطاق GFP. باستخدام مسار Z مقبض التكيف، والمسح الضوئي من خلال Z-محور الدماغ لتحديد موقع منطقة الدماغ من الفائدة. استخدم وظيفة المحاصيل لتركيز المسح على المنطقة ذات الاهتمام فقط ، لتقليل وقت المسح الضوئي.
وتدوير عرض المسح الضوئي بحيث تواجه الأمامي من الرأس إلى أسفل. ثم اضبط حجم الإطار إلى 512 بكسل في 512 وحدد المنطقة المراد مسحها ضوئيًا. مع الأخذ في الاعتبار الوقت المسح المحسوب لكل إطار، لتحقيق معدل الإطار من أربعة هرتز على الأقل.
للتصور العابر للكالسيوم الذي يثير الرائحة ، ابدأ حزمة ماكرو مبرمجة مسبقًا قادرة على ربط برنامج الحصول على الصور وبرنامج تسليم الرائحة وتبدأ القياس في برنامج المجهر لمدة 6.25 ثانية لإنشاء قيمة خط أساس F0. في نظام تسليم الرائحة، وتقديم 2.5 ثانية من التحفيز رائحة المشار إليها هنا من خلال إضاءة LED التي أثارها فتح وإغلاق صمامات كأس رائحة محددة. تليها 12.5 ثانية من تسجيل في نهاية إزاحة رائحة.
ثم كرر التسليم لرائحة ثانية وثالثة بنفس الطريقة. لتنفيذ تكييف النقابي في هذا الإعداد، استخدم نظام تسليم رائحة الكمبيوتر التي تسيطر عليها لتقديم التحفيز مشروطة زائد رائحة لمدة 60 ثانية جنبا إلى جنب مع 12 90 فولت الصدمات الكهربائية. بعد 60 ثانية كسر الحالي التحفيز مشروطة ناقص رائحة وحدها لمدة 60 ثانية دون صدمة كهربائية.
قياس رائحة ما بعد التدريب أثار الترانليس الكالسيوم مرة أخرى عن طريق تكرار بروتوكول التحفيز قبل التدريب رائحة ثلاث دقائق بعد الانتهاء من مرحلة التدريب. ثم احفظ ملفات التصوير في تنسيق مناسب لتحليل الصورة لاحقًا. هنا فطر تمثيلية الجسم إخراج صور الخلايا العصبية, المكتسبة كما هو موضح يمكن ملاحظتها.
التعبير المجزأ المحدد لاستشعار dHomer-GCaMP3، الذي لا يعبر عنه في مقصورات محور عصبي من الخلايا العصبية، يدل على إشارة متخللة في المقصورة التشعب. يمكن ملاحظة ردود واضحة على الرغم من انخفاض رائحة السعة في الذباب التعبير عن dHomer-GCaMp3، مقارنة بالذباب الذي يعبر عن cytosolic GCaMP6f. هنا، آثار الكالسيوم التمثيلية من ذبابة فردية واحدة يوضح التباينات في مستوى الضوضاء والسعة التي يمكن الحصول عليها بين الاستعدادات الفردية.
وقد فتحت هذه التقنية إمكانية تصور على المستوى الفرعي الخلوي، وكيف يتم تعديل التمثيلات الشمية وكيف يتم تشكيل مراحل الذاكرة من خلال تكييف. وستكون مثل هذه التجارب حيوية لتوسيع فهمنا لهياكل الدماغ المعقدة مثل جسم الفطر، وتوصيف كيفية تخزين الذكريات النقابية عبر مجموعات الخلايا العصبية الموزعة.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
