Neuroscience
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विवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में लर्निंग-प्रेरित सिंपटिक प्लास्टिकिटी में ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर
Chapters
Summary October 8th, 2019
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यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसके साथ Drosophila सीखने और स्मृति के संदर्भ में पूर्व और/या postsynaptic कैल्शियम कल्पना की जा सकती है. vivo कैल्शियम इमेजिंग में synaptically स्थानीयकृत कैल्शियम सेंसर का उपयोग कर एक शास्त्रीय घ्राण कंडीशनिंग प्रतिमान इस तरह है कि synaptic प्लास्टिक साहचर्य सीखने के इस प्रकार अंतर्निहित निर्धारित किया जा सकता है के साथ संयुक्त है.
Transcript
यह तकनीक ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सीखने और स्मृति गठन में अंतर्निहित सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए एक शारीरिक पैरामीटर के रूप में सिनैप्टिक कैल्शियम गतिविधि के वास्तविक समय में अवलोकन की सुविधा प्रदान करती है। साहचर्य प्रशिक्षण से पहले और बाद में गंध के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की तुलना करके, हम सिनैप्टिक गतिविधि और व्यक्तिगत फल मक्खियों में मेमोरी ट्रेस के गठन के बीच सीधे सहसंबंध आकर्षित कर सकते हैं। ट्रांसजेनिक फल मक्खियों का उत्पादन करने के लिए जिसमें ब्याज के विशिष्ट न्यूरॉन्स एक आनुवंशिक रूप से इनकोडेड कैल्शियम संकेतक पार महिला-कुंवारी और पुरुष मक्खियों वांछित GAL4 और UAS निर्माण ले जाने व्यक्त करते हैं, और तीन से छह दिनों के बाद eclosion के बाद तक महिला संतान उंर ।
इमेजिंग के लिए एक फ्लाई तैयार करने के लिए, एक कस्टम तैयार इमेजिंग कक्ष में बर्फ एनेस्थेटाइज्ड फ्लाई रखने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। कक्ष के तल पर बिजली के तारों के संपर्क में छाती और पैरों की स्थिति के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, और सिर के साथ फ्लैट झूठ बोल रही है। स्पष्ट चिपकने वाले टेप के साथ फ्लाई को ठीक करें, और सिर के चारों ओर टेप में एक खिड़की काटने के लिए एक सर्जिकल स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें, एंटीना को कवर किया गया और केवल छाती के अधिकांश हिस्से को उजागर किया।
नीले प्रकाश इलाज गोंद के साथ पक्षों और सिर के पीछे ध्यान से घेरने के लिए अवतल-उत्तल जबड़े द्वारा आयोजित एक कीट पिन का उपयोग करें। और गोंद सेट करने के लिए एक नीली रोशनी उत्सर्जक एलईडी लैंप का उपयोग करें। जब गोंद पूरी तरह से सेट होता है, तो फ्लाई हेड की पृष्ठीय सतह से किसी भी अवशिष्ट अहानिकर गोंद को साफ करें और रिंगर के समाधान की एक बूंद के साथ सिर के उजागर छल्ली को कवर करें।
एक बहुत ही ठीक ब्लेड चाकू चाकू का उपयोग करना, सिर के पीछे के पार क्यूटिकल के माध्यम से काटा जाता है, ओस्ली से शुरू होता है और प्रत्येक पक्ष को काटने के लिए आंखों में मध्यशास्त्र को काटना जो कि आसानी से संदंश का उपयोग करके फाड़ा जा सकता है। किसी भी अतिरिक्त छल्ली को हटा दें जो ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र को अवरुद्ध कर सकता है और मस्तिष्क के ऊतकों के व्यवधान से बचने के लिए ध्यान से किसी भी श्वासनली की पृष्ठीय सतह को साफ करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग कर सकता है। ऊतक मलबे के क्षेत्र को साफ करने के लिए आवश्यक रिंगर के समाधान को हटाएं और ताज़ा करें।
और फ्लाई के सिर से लगभग एक सेंटीमीटर हाइपोडर्मिक गंध वितरण सुई रखें, ध्यान रखें कि एंटीना में गंध वितरण में बाधा डालने वाला कुछ भी नहीं है। फिर हाइपोडर्मिक गंध डिलीवरी सुई के माध्यम से इमेजिंग चैंबर को गंध वितरण प्रणाली से जोड़ें। और एनेस्थीसिया और सर्जरी से उबरने के लिए फ्लाई को 10 मिनट की अनुमति दें।
जीएफपी आधारित कैल्शियम संकेतकों के दृश्य के लिए, एक अवरक्त लेजर से लैस एक बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोप के लेजर को ट्यून करें और एक कंपन अलग टेबल पर स्थापित पानी विसर्जन उद्देश्य 920 नैनोमीटर की एक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य के लिए और एक जीएफपी बैंडपास फिल्टर स्थापित करें। पाठ्यक्रम जेड समायोजन घुंडी का उपयोग करना, मस्तिष्क के जेड-अक्ष के माध्यम से स्कैन करने के लिए ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र का पता लगाने के लिए । स्कैन समय को कम करने के लिए, केवल ब्याज के क्षेत्र पर स्कैनिंग ध्यान केंद्रित करने के लिए फसल समारोह का उपयोग करें।
और स्कैन दृश्य को इस तरह घुमाएं कि सिर के पूर्वकाल को नीचे की ओर सामना करना पड़ रहा है। फिर फ्रेम साइज को 512 पिक्सल तक एडजस्ट करें और स्कैन किए जाने वाले क्षेत्र का चयन करें। प्रत्येक फ्रेम के लिए गणना स्कैन समय को ध्यान में रखते हुए, कम से कम चार हर्ट्ज की फ्रेम दर प्राप्त करने के लिए।
गंध-पैदा कैल्शियम क्षणिक दृश्य के लिए, छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और गंध वितरण कार्यक्रम को जोड़ने में सक्षम एक पूर्व प्रोग्राम मैक्रो पैकेज शुरू करें और एफ0 बेसलाइन मूल्य स्थापित करने के लिए 6.25 सेकंड के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में माप शुरू करें। गंध वितरण प्रणाली में, विशिष्ट गंध कप वाल्व के उद्घाटन और समापन से एलईडी के ट्रिगर की रोशनी से यहां इंगित 2.5 सेकंड गंध उत्तेजना प्रदान करें। गंध ऑफसेट के अंत में रिकॉर्डिंग के १२.५ सेकंड के बाद ।
इसके बाद एक दूसरे और तीसरे गंध के लिए डिलीवरी को उसी तरीके से दोहराएं। इस सेटअप में साहचर्य कंडीशनिंग करने के लिए, 12 90 वोल्ट बिजली के झटके के साथ 60 सेकंड के लिए वातानुकूलित उत्तेजना-प्लस-गंध पेश करने के लिए कंप्यूटर नियंत्रित गंध वितरण प्रणाली का उपयोग करें। एक ६० दूसरे ब्रेक के बाद वातानुकूलित उत्तेजना-माइनस गंध अकेले बिजली के झटके के बिना ६० सेकंड के लिए मौजूद हैं ।
प्रशिक्षण चरण खत्म करने के तीन मिनट बाद पूर्व प्रशिक्षण गंध उत्तेजना प्रोटोकॉल को दोहराकर पोस्ट प्रशिक्षण गंध को फिर से कैल्शियम ट्रान्सियेंस पैदा करें। फिर इमेजिंग फ़ाइलों को बाद में छवि विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त प्रारूप में सहेजें। यहां प्रतिनिधि मशरूम शरीर उत्पादन न्यूरॉन छवियों, प्रदर्शन के रूप में अधिग्रहीत देखा जा सकता है।
dHomer-GCaMP3 सेंसर की विशिष्ट विभाजित अभिव्यक्ति, जो न्यूरॉन के अक्षीय डिब्बों में व्यक्त नहीं की जाती है, डेंड्रिटिक डिब्बे में एक विरामित संकेत को दर्शाती है। स्पष्ट है कि साइटोसोलिक GCaMP6f व्यक्त मक्खियों की तुलना में, धोमर-जीसीएएमपी 3 व्यक्त करने वाली मक्खियों में कम आयाम गंध प्रतिक्रियाएं देखी जा सकती हैं। यहां, एक व्यक्तिगत फ्लाई से प्रतिनिधि कैल्शियम निशान शोर के स्तर और आयाम में विचरण को दर्शाता है जिसे व्यक्तिगत तैयारी के बीच प्राप्त किया जा सकता है।
इस तकनीक ने उप-सेलुलर स्तर पर कल्पना करने की संभावना को खोल दिया है, घ्राण अभ्यावेदन कैसे संग्राहक होते हैं और कंडीशनिंग के माध्यम से स्मृति चरण कैसे बनते हैं। इस तरह के प्रयोगों के लिए इस तरह के मशरूम शरीर के रूप में जटिल मस्तिष्क संरचनाओं के बारे में हमारी समझ का विस्तार महत्वपूर्ण होगा, और विशेषता कैसे साहचर्य यादें न्यूरॉन्स की वितरित आबादी में संग्रहीत कर रहे हैं ।
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