Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Purkinje-cellernes overlevelse i Udsnitskulturer af Organotypiske cerebellar
Chapters
Summary December 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Organotypiske skive kulturer er et kraftfuldt værktøj til at studere neuroudviklingsmæssige eller degenerative/regenerative processer. Her beskriver vi en protokol, der modeller den neuroudviklingsmæssige død af Purkinje celler i mus cerebellar skive kulturer. Denne metode kan gavne forskning i neuroprotektive Drug Discovery.
Transcript
Organotypisk skivekultur er et effektivt værktøj til at studere neuroudviklingsmæssige og degenerative eller regenerative processer. Denne teknik kan bruges til hurtigt at screene kandidat molekyler for deres neuroprotektive potentiale. Denne metode nøje efterligner i vivo betingelser, sammenlignet med dissocierede primære cellekulturer, som væv sæt arkitektur og indfødte celle-celle forbindelser bevares i de planer af sektionerne.
Her viser vi studiet af Purkinje celledød i den udviklende lillehjernen. Men organotypisk skive kultur er lige så velegnet til model neurodegenerative sygdomme i næsten alle centralnervesystemet region. Demonstrere proceduren med Jennifer Rakotomamonjy vil være Sean McDermott, en tekniker fra mit laboratorium.
Før høst cerebellar skiver, i en steriliseret biosikkerhed kabinet, fylde hver brønd af en seks-brønd kultur plade med en milliliter vakuum-filtreret kultur medium, og tilsæt farmakologisk agent af interesse for behandling brønde, og en lige mængde køretøj til kontrol brønde. Brug sterile kraftvipper, placere en 0,4-mikrometer pore størrelse PTFE membran filter indsætte i hver brønd, idet du skal passe på at undgå bobler på grænsefladen af hver membran og mediet, og ækvibrer medium i en 37 grader Celsius og 5% kuldioxid inkubator i to timer. At høste lillehjernen, bruge lige dressing kraftvipper til at gribe hvalpen hovedet ved næsen, og bruge lige øje saks til at skære åbne hovedbunden fra den bageste ende sideom side til midterlinjen.
Skær kraniet op på samme måde og peg saksspidserne udad for at undgå at beskadige lillehjernen, og brug en spatel til at overføre hjernen til en 60-millimeter skål indeholdende kold HBSS og fem milligram pr. milliliter glukose. Brug lige dressing kraftang til omhyggeligt dissekere ud lillehjernen, og bruge sterile buede fine kraftang til at placere vævet på en plastik skive på skærebordet af en væv chopper. Drej skærebordet for at orientere vævet, så der kan anskaffes parasagittalsektioner, og træk bordudløserknappen til højre for at flytte skærebordet, indtil klingen er placeret ved kanten af vævet.
Juster derefter skivetykkelsen til 350 mikrometer, og klingens hastighed til medium, og start hakkeren. Når hele lillehjernen er skåret, skal du slukke for helikopteren. Brug sterile kraftbecer, hold disken over en ny 60-millimeter skål.
Brug en overførselspipette til at skylle HBSS plus glukose over disken, så skiverne falder ned i skålen. Derefter rører prøverne så minimalt som muligt, skal du bruge en mikrosonde til at adskille skiverne. Brug overførselspipetten til at vælge dele af lillehjernen tæt på vermis på individuelle cellekulturindsatser i seks-brøndpladen, og brug mikrosonden til at placere skiverne i midten af hvert skær.
Når alle skiverne er placeret, aspirere forsigtigt overskydende HBSS plus glukose, og returnere pladen til cellekultur inkubatoren. For immunfluorescensfarvning fjernes supernatanten fra hver brønd, og skærne vaskes med PBS. Fastgør skiverne med en milliliter kold 4% paraformaldehyd i brønden af hver indsats, og 500 mikroliter oven på hver indsats i en time.
Ved afslutningen af fikseringen vaskes skærene fire gange i 10 minutter med en milliliter frisk PBS under hvert skær og 500 mikroliter frisk PBS oven på hver indsats pr. vask på en orbitalshaker. Forfyld hver brønd af en 24-brønd plade med 500 mikroliter PBS-TB, og brug en pensel til at overføre cerebellar skiver fra hver cellekultur indsætte i individuelle brønde af en 24-brønd plade. Permeabilize og blokere skiver ved stuetemperatur i en time.
Ved inkubationens afslutning mærkes cellerne med 200 mikroliter af det primære interesseantistof, der fortyndes i PBS-TB pr. brønd natten over ved fire grader Celsius på orbitalshaskeren. Næste morgen vaskes skiverne fire gange i 10 minutter og 500 mikroliter frisk PBS pr. vask på shakeren, før prøverne mærkes med de relevante fluorophorekonjugered sekundære antistoffer i to timer ved stuetemperatur på rysteren, beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning modvirkes sektionerne med 500 mikroliter af en passende nuklear plet pr. brønd i 10 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
Og brug en overførselspipette til at montere skiverne på glasdias. Lad derefter sektionerne lufttørre helt, før de rehydreres med PBS og montere væv med dækslæber belagt med ca. 80 mikroliter monteringsmedium. Når monteringsmediet er hærdet, er cerebellar-sektionerne klar til at blive afbildet.
På postnatal dag seks, Purkinje celle overlevelse er lav i kontrol prøver, i overensstemmelse med deres kendte sårbarhed vindue. Overlevelse stiger som donordyret bliver ældre og forlader denne kritiske periode. Behandlingen af cerebellar skiver med en høj koncentration af kaliumchlorid resulterer i en vellykket induktion af deres depolarisering og overlevelse.
For at opnå ensartede og reproducerbare resultater er det afgørende at vælge sunde cerebellarsektioner og at udføre kulturopsætningen så effektivt som muligt. Post-kultur applikationer går ud over immunfluorescens. Som organotypiske skiver kan bruges til genom protein ekspression undersøgelser, og til overvågning neuronal kredsløb aktivitet ved hjælp af elektrofysiologi og calcium levende billeddannelse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
