Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Samling av frosne gnagerhjerneregioner for nedstrøms analyser
Chapters
Summary April 23rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne prosedyren beskriver samlingen av diskrete frosne hjerneregioner for å oppnå protein av høy kvalitet og RNA ved hjelp av billige og allment tilgjengelige verktøy.
Transcript
Denne prosedyren beskriver samlingen av diskrete frosne hjerneregioner for å oppnå protein og RNA av høy kvalitet ved hjelp av billige og allment tilgjengelige verktøy. Fordi hjerneregioner holdes frosset fra høst gjennom disseksjon, bevares målmolekyler og forskeren har tid til å nøye dissekere og lagre områder av interesse. Å identifisere interesseområder kan i utgangspunktet være utfordrende.
Ved hjelp av vanlige hjernelandemerker som de dukker opp og går tilbake gjennom seksjonene i forhold til de ønskede regionene vil gjøre identifikasjon klart. Etter å ha fjernet hjernen fra eutaniserte voksne CD-1 villtypemus, fryse vevet i 60 sekunder i enten flytende nitrogen eller isopentane. Pre-chill med tørris og lagre den på minus 80 grader Celsius.
24 timer før dissekere vevet, plasser en ren hjernematrise på en stabel med tinte frysepakker. Og smør sidene til matrisen mellom to frysepakker som sørger for å forlate omtrent en halv centimeter mellom bunnen av barberhøvelsporene og toppen av pakkene. Sett opp en frossen glassplate for disseksjonen ved å fylle en isolert boks med is opp til omtrent fem centimeter fra toppen.
Legg deretter et 2,5 centimeter lag tørris på toppen. Og dekk den med svart plastfolie. Plasser en glassplate på toppen av plasten.
Og tørris rundt grensen til platen. Fjern den frosne hjernematrisen fra fryseren og sett hjernen, cortex side opp, inn i matrisen. La vevet likevekte til temperaturen i boksen i 10 minutter.
Holde lokket åpent i løpet av denne tiden. Bruk kalde tang til å justere hjernens posisjon i matrisen slik at sagittal sinus og tverrgående sinus linje opp med vinkelrett spor av blokken. Når hjernen er i posisjon, plasser et kjølt barberblad nær midten og trykk det omtrent en millimeter inn i vevet.
Deretter plasserer du ett kjølt blad i hver ende av hjernen og trykker helt ned i matrisen. Begynn deretter å legge til kjølte blader i rostralenden, plassere dem i sporene en om gangen og forsiktig trykke dem en millimeter inn i vevet. Fortsett å legge til blader med ett millimeter intervaller, arbeider mot den kaudale enden.
Når alle bladene er på plass, trykk ned på toppen med fingre, håndflate, eller en stump gjenstand og rock dem sakte fra side til side for å flytte dem gjennom vevet. Når bladene har nådd bunnen av sporene, ta tak i hver side av gruppen av blader og frigjøre dem fra matrisen ved å gynge frem og tilbake. Etter å ha frit gruppen av blader plassere dem rostral side opp på glassplaten, og sette tørris ved siden av eller på toppen av stabelen for å ytterligere fryse prøvene for enklere separasjon.
Plasser deretter stabelen med skarpe kanter ned og skill bladene ved å flytte stabelen mellom tommelen og fingrene. Linje opp avsnittet på glassplatene fra rostral til caudal og skille vevet fra bladene ved å bøye dem mellom fingrene, eller ved å skille dem med et annet kjølt blad. Til tider kan vev holde seg til begge sider av et blad og det må tas hensyn til å opprettholde rostral til caudal orientering.
Før du starter disseksjonen, åpner du Allen Mouse Brain Atlas eller en annen referanse og finner landemerkene som er nødvendige for å identifisere områder av interesse. Bruk kjølte tang eller blader til å vende seksjonen. Og sørg for at interesseregionen er konsistent i hele seksjonen.
Skjær inn i seksjonen med en ren skalpell eller et slag, og skyv metallet forsiktig, men fast inn i vevet. Rocking det frem og tilbake for å gjøre kuttet. Etter høsting av interesseområdet, legg den i merkede forhåndskjølte 1,5 millimeter rør og lagre dem på minus 80 grader Celsius.
For å behandle vevet, tilsett kald RIPA-buffer for proteinekstraksjon eller et guanidinium som inneholder løsningsmiddel for RNA-ekstraksjon og homogeniser det umiddelbart med en glassned eller mekanisk homogenisator. For å validere denne metoden ble den mediale prefrontale cortex samlet inn fra voksne CD-1 villtype hannmus, og RNA og protein ble karakterisert. Når analysert med kapillær elektroforese, degradert RNA viser et tap i intensiteten av 28S og 18S ribosomale bånd, samt et smør mellom 25 og 200 nukleotider.
Mens RNA av høy kvalitet viser distinkte ribosomale bånd lite eller ingen signal i det nedre molekylvektsområdet. RNA oppnå ved hjelp av den frosne disseksjonsmetoden ble sammenlignet med RNA tilberedt av nyhøstet vev. Begge metodene produserer RNA med høye integritetstall og sterk ribosomal banding.
For å bekrefte at denne metoden kan brukes til å bevare mikromiljøet av dissekert vev for senere analyse, ble RNA hentet fra dissekert mediale prefrontal cortex som hadde blitt lagret over flere uker. Alle prøvene produserte RNA av høy kvalitet med distinkt ribosomal banding og RNA-integritetstall over åtte. For å bekrefte proteinintegriteten til de frosne dissekerte prøvene ble proteinet samlet inn, overført til nitrocellulose og sonde med antistoff mot det høye molekylvektsmålet KCC2, og det lavere molekylvektsproteinet actin.
I alle tilfeller var band skarpe og distinkte uten merkbare nedbrytningsprodukter. Det er viktig å holde vevet frosset gjennom hele prosessen, da dette bevarer mikromiljøet av seksjonene og opprettholder seksjonsmorfologi for sammenligning med hjerneatlasbilder. Regioner av interesse samlet på denne måten kan lagres i flere måneder ved negativ 80 grader Celsius og kan benyttes i mange nedstrøms applikasjoner, inkludert RT-qPCR, RNA-Seq, Western blot analyse, og HPLC.
Denne metoden har blitt brukt til å utforske molekylære endringer i de limbiske systemene til perinatale gnagere utsatt for THC og andre cannabinoider for å bedre forstå hvordan disse stoffene kan påvirke hjernens utvikling.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
