Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection
Author Produced

This content is Open Access.

JoVE Journal Immunology and Infection

Kvantificering af staphyloccus aureus cytotoksicitet mod humane Polymorphonukleare leukocytter

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Journal (Immunology and Infection)

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Journal (Immunology and Infection)

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in Apc^Min/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Click here for the English version

Kvantificering af staphyloccus aureus cytotoksicitet mod humane Polymorphonukleare leukocytter

Article DOI: 10.3791/60681-v

January 3rd, 2020 •

Jennifer G. Dankoff¹, Kyler B. Pallister¹, Fermin E. Guerra¹, Alexander J. Parks¹, Kelly Gorham², Saul Mastandrea², Jovanka M. Voyich¹, Tyler K. Nygaard¹

¹Department of Microbiology and Immunology, Montana State University, ²University Communications, Montana State University

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

January 3rd, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne protokol beskriver en metode til rensning af polymorphonukleare leukocytter fra hele humant blod og to særskilte analyser, der kvantificerer cytotoksicitet af Staphylococcus aureus mod disse vigtige medfødte immunceller.

Transcript

Staphylococcus aureus er en gram-positive bakterier, der producerer en bred vifte af virulens faktorer, der fremmer patogenese. Disse omfatter bi-komponent leukotoksiner, der forstyrrer membranen integritet polymorphonuclear leukocytter, også kaldet PMNs eller neutrofiler. Denne video illustrerer isolering af PMN'er fra humant fuldblod og to forskellige analyser for kvantificering af S.aureus cytotoksicitet mod disse vigtige medfødte immunceller.

Disse analyser kan alle udføres med standard laboratorieudstyr og er let kan tilpasses til at undersøge andre aspekter af vært patogen interaktion. Disse forsøg vil bruge fuldblod fra menneskelige donorer og vil kræve godkendelse fra det relevante institutionelle udvalg eller revisionsudvalg samt en erklæring om, at informeret samtykke blev indhentet fra alle deltagere. Det første skridt i denne procedure er isolering af neutrofiler ved hjælp af centrifugering og tæthed gradienter.

Først skal du medbringe 50 milliliter 3%dextran 0,9% natriumchlorid, 35 milliliter 0,9% natriumchlorid, 20 milliliter 1,8% natriumchlorid, 12 milliliter 1,077 gram pr. milliliter ficoll opløsning og 20 milliliter vand til stuetemperatur. Overfør 25 milliliter nytrukket hepariniseret fuldblod i to koniske centrifugerør. Kombiner 25 milliliter nytrukket hepariniseret fuldblod med 25 milliliter ækvivalent volumen af stuetemperatur, 3% dextran, 0,9% natriumchlorid i et en-til-en forhold.

Bland ved forsigtigt rokkende hver 50 milliliter koniske rør og lad derefter stå ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubation ved stuetemperatur vises to separate lag. Overfør det øverste lag af hver dextran blodblanding i nye 50 milliliter koniske rør.

Centrifuge ved 450 g i 10 minutter ved stuetemperatur med lave eller ingen pauser. Inspirer forsigtigt både supernatanter og kassér uden at forstyrre cellepillerne. Resuspend hver cellepellet opvarmes forsigtigt i to milliliter 0,9% natriumchlorid.

Kombiner de resuspenderede pellets i en enkelt, 50 milliliter konisk derefter tilføje de resterende 0,9% natriumchlorid til et endeligt volumen på 35 milliliter. Underlæg omhyggeligt 10 milliliter 1,077 gram pr. milliliter ficoll-opløsning under celleaffjedringen ved hjælp af en håndpipette. Efter spinding ved 450 g i 30 minutter ved stuetemperatur, med lav eller ingen pauser, let aspirere supernatant uden at forstyrre cellille, som tidligere vist.

Lyse de røde blodlegemer ved at resuspending celle pellet i 20 milliliter stuetemperatur vand. Bland forsigtigt ved at rokke i 30 sekunder. Der tilsættes straks 20 milliliter 1,8 % natriumchlorid og centrifugeprøve ved 450 g i 10 minutter ved stuetemperatur.

Inspirer forsigtigt supernatant som vist før. Forsigtigt resuspenderet celle pellet i to milliliter stuetemperatur RPMI og sted på is. Tæl celler ved hjælp af et hemacytometer.

Resuspend renset PMN'er i en koncentration på en gange 10 til 7th celler per milliliter med iskold RPMI og holde på is. Kombiner 100 mikroliter af rensede PMN'er med 300 mikroliter DPBS, der indeholder en mikroliter propidiumdodidplet i to replikerede flowcytometrirør. For en positiv kontrol, tilsæt 40 mikroliter af 0,5% Triton X-100 opløsning i en af flow cytometri rør og bland grundigt.

Brug flowcytometri til at måle den fremadrettede scatter, side scatter, og propidium iodid farvning til at bestemme renhed og integritet af isolerede PMN'er. Der bør kun anvendes PMN-præparater, der er over 98 % rene og over 95 %propidiumdodidæt. For protokollen, der skitserer isolering af normalt menneskeligt serum, henvises til det fulde manuskript.

Forbered en 96-brønd plade til PMN cytotoksicitet assays ved at tilføje 100 mikroliter af 20% isolerede humant serum fortyndet med DPBS til individuelle brønde, der vil blive brugt i denne analyse. Sørg for at inkludere mindst én negativ kontrol brønd, der kun vil modtage medier og mindst én positiv kontrol godt, der vil modtage 0,05% Triton X.Inkubere pladen ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Efter inkubationen vaskes de kodede brønde to gange med 100 mikroliter iskold DPBS og læg pladen på is.

Fjern eventuelle resterende DPBS fra pladebæde og tilsæt forsigtigt 100 mikroliter af rensede humane PMN'er på én gang 10 til 7. Tillad belagte neutrofiler at bosætte sig ved at efterlade dem på is i mindst fem minutter før brug i følgende cytotoksicitetsanalyser. Dette afsnit beskriver en analyse, der kvantificerer cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af staph aureus mod humane PMN'er.

Kultur S.aureus natten over i passende medier ved hjælp af en rystende inkubator sat til 37 grader Celsius dagen før eksperimentet. Subkultur S.aureus ved at udføre en en til 100 fortynding af natten bakterier kulturer med friske medier. Inkubere ved 37 grader Celsius med rysten, indtil bakterierne når tidlig stationær vækstfase.

Efter fem timers vækst overføres en milliliter subkultur S.aureus til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og centrifuge ved 5.000 g i fem minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering, aspirere supernatants. Pass indsugning supernatants gennem en 0,22 mikron sprøjte filter i en ny 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og sted på is.

Udfør serielle fortyndinger af supernatanter med iskolde medier, der bruges til at dyrke Staph aureus. Tilsæt forsigtigt supernatantprøver eller medier udlånt til negative og positive kontroller til individuelle brønde af en 96-brøndplade, der indeholder PMN'er på is, som beskrevet tidligere. Forsigtigt rock plade til at distribuere supernatanter i brønde og inkubere ved 37 grader Celsius.

På de ønskede tidspunkter skal du fjerne pladen fra inkubatoren og placere på is. Der tilsættes 300 mikroliter iskold DPBS, der indeholder en mikroliter propidiumdodid til hvert flowcytometrirør. Overfør prøverne for at flyde cytometrirør på is.

For den positive kontrol godt, tilsæt 20 mikroliter af 10% Triton X til prøven før overførsel til et flow cytometri rør. Analysér propidiumidodidfaring af berusede PMN'er ved hjælp af flowcytometri. Dette afsnit beskriver en analyse, der kvantificerer cytotoksiciteten af S.aureus efter fagocytose af humane PMN'er.

Vækstkurver defineret ved den optiske massen ved 600 nanometer og koncentrationen af bakterier skal bestemmes for de relevante Staph aureus stammer før brug i denne analyse. Start natten kulturer S.aureus stammer og subkultur bakterier, som beskrevet tidligere. Når subkultureret Staph aureus har nået midten af eksponentiel vækst, overføre en milliliter af kultur bakterier til 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og centrifuge ved 5, 000 g i fem minutter ved stuetemperatur.

Vask S.aureus ved at aspirere sin supernatant uden at forstyrre pellet og resuspend de pelleterede bakterier på en milliliter DPBS. Vortex prøverne i 30 sekunder. Centrifuge prøverne ved 5,000 g i fem minutter ved stuetemperatur.

For at oxenize Staph aureus, først resuspend den bakterielle pellet i en milliliter 20% humant serum. Derefter inkuberes prøver ved 37 grader Celsius med omrøring i 15 minutter. Vask oxenized Staph aureus efter centrifugering som vist tidligere.

Fortyndet oxenized Staph aureus stammer til en gange 10 til 8th koloni-dannende enheder, CFUs per milliliter, med iskold RPMI. Vortex prøven i 30 sekunder og sted på is. Bekræft koncentrationerne af Staph aureus, der anvendes til disse analyser ved at grundfælde en til 10 serielle fortyndinger af bakterier på agar.

Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter pr. brønd af hver Staph aureus stamme, eller RPMI for positive og negative kontroller, til PMN'er i en 96-brønd plade på is fra trin 1.14. Forsigtigt rock plade til at distribuere Staph aureus i brønde. Synkroniser fagocytose ved centrifugering plade ved 500 g i otte minutter ved fire grader Celsius og inkuber plade ved 37 grader Celsius umiddelbart efter centrifugering som tid nul.

På de ønskede tidspunkter, sætte pladen på is og tilsæt 200 mikroliter af iskold DPBS indeholder en microliter propidium iodid til hver flow cytometri rør derefter overføre prøver til deres tilsvarende rør. Analysér prøver til propidiumdodidfaring ved hjælp af flowcytometri som beskrevet i 2.8 og 2.9. Transskriptionen af tokomponent leukotoksiner, der er rettet mod humane PMN'er ved Staph aureus, kræver, at SA- eller S2-komponentsystemet demonstrerer nytten af de beskrevne analyser til kvantificering af Staph aureus-cytotoksicitet mod humane PMN'er.

Disse forsøg blev udført med et klinisk relevant Staph aureus isolat identificeret som USA300 i en isologenisk sletning mutant af SA eller S i denne stamme. Det venstre panel viser rensede PMN'er, og højre panel skildrer bevidst forurenede prøver som et eksempel. PMN'er, der var isoleret ved hjælp af de procedurer, der er beskrevet i afsnit et i denne protokol, blev plettet med propidiumidodid og undersøgt ved hjælp af flowcytometri.

Frem- og sidesprømmeområder blev anvendt til at påvise kontaminering af rensede PMN'er med monocytter eller lymfocytter i årevis 1A og 1B. PMN-integritet blev bestemt ved hjælp af propidiumdodidfaring. Ved at bruge den beskrevne metode til human PMN rensning, kan vi konsekvent isolere fem gange 10 til 7th til en gange 10 til 8th PMNs, der er over 98% ren og er over 95% propidium iodid negative.

Cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af USA300 og AsaeR/S-mutanten blev testet mod rensede PMN'er. Disse forsøg viser en koncentrationsafhængig stigning i propidiumdodidfaringen af rensede PMN'er efter 30 minutters forgiftning med ekstracellulære proteiner produceret af USA300, men ikke med AsaeR/S-mutanten. Yderligere forsøg viste en støt stigning i andelen af propidium iodid positive PMNs efter forgiftning af USA300 ekstracellulære proteiner, plateaued efter ca 30 minutter.

Minimal propidiumidodidfaring af humane PMN'er blev bemærket på alle tidspunkter efter eksponering for ekstracellulære proteiner produceret af AsaeR/S-mutanten. Sidst blev cytotoksiciteten af USA300 og AsaeR/S mutant mod PMN'er efter synkroniseret fagocytose testet, en koncentrationsafhængig stigning i andelen af propidiumidodid positive PMN'er blev observeret 90 minutter efter fagocytose af USA300. Betydeligt færre PMN'er var propidiumdodide positive efter asaeR/S-mutantens fagocytose.

Optælling af USA300 og AsaeR/S mutant inoculum blev anvendt i hvert af disse forsøg, viste, at kontrasten i cytotoksicitet mellem disse stammer ikke skyldtes forskelle i koncentrationen af de anvendte bakterier. Denne protokol beskriver rensninger af PMN'er fra humant blod i to forskellige teknikker til kvantificering af cytotoksicitet af S.aureus mod disse medfødte immunceller. Disse procedurers succes vil afhænge af kvaliteten af de rensede PMN'er og den passende forberedelse af Staph aureusbakterier eller supernatanter.

Se hele manuskriptet for vigtige punkter at overveje, mens du udfører disse procedurer. USA300 er en ondartet MRSA isolat og tabet af AsaeR / S dramatisk reducerer transskription af virulens faktorer, der er rettet mod menneskelige PMNs, hvilket gør disse stammer ideelle modeller til sammenligning cytotoksicitet ved hjælp af de beskrevne analyser. Skræddersy vækstbetingelser, mængder af supernatanter tilsat, eller forholdet mellem bakterier til PMNs kan være påkrævet, når du bruger andre stammer af Staph aureus.

X

Simple Hit Counter