Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Retrograde sporing af Drosophila embryonale motoriske neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer
Chapters
Summary January 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metode til tilbagesporing af Drosophila embryonale motor neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer.
Transcript
Den sporing teknik, der er beskrevet i denne protokol hjælper os med at studere neuronal morfogenese og snap forbindelsen i den motoriske neuron system af Drosophila. Den lipofile farvestof kan hurtigt diffuse til alle dele af cellulære membran med en ekstremt høj tæthed. Det er derfor, vores protokol effektivt løser at finde strukturer af en mærket neuron.
Hvis en axonterminal er tilgængelig med en mikropipette til injektion, kan denne teknik anvendes på enhver neuron i larve- og voksenstadiet af fluer eller i andre organismer. Hvis du ikke har nogen erfaring dissekere eller ved hjælp af en microinjector præcis operationen på prøven, kan være udfordrende. Forståelse af anatomi af fosteret, vil hjælpe med vejledning til korrekt portioning af værktøjer til at udføre dissektion eller en dinjection.
For at starte, forberede og layoute alle embryoopsamlingsmaterialer. Opbered filtreringsapparatet ved at skære et 50 milliliterrør af og åbne et hul i hætten. Sæt derefter et meshfilter med 100 mikrometerporer mellem røret og hætten.
Forbered farvestof injektion mikropipette og dissektion nål fra samme kapillær slange med en indre diameter på 1,2 millimeter. Træk slangen med en mikropipette, puller på 7% fra 170 volt maksimal effekt for at skabe en skarp nål med en konus på omkring 0,4 centimeter i længden. For at forberede farvestoffet injektion mikropipette, sættehad kværnen med en befugtningsmiddel og placere nålen på mikropipette klemme på 25 til 30 grader.
Sænk derefter spidsen ned på to tredjedele af radiussen ud fra midten af bevelingsoverfladen. Grind nålen, mens en sprøjte med slanger skubber luft ind i den. Marker mikropipetten med en fin spids permanent markør for at angive placeringen af åbningen på spidsen efter beveling, fordi det kan være udfordrende at finde den smalle åbning, der dannes i en vinkel.
Lad fluerne lægge æg natten over ved stuetemperatur og opsaml røret med æggene om morgenen. For at indsamle embryoner, dechlorinere æggene på pladen med 50% blegemiddel i fem minutter. Når kloriderne er fjernet, hældes indholdet af pladen gennem filtreringsapparatet eller cellesen for at isolere embryonerne.
Brug en squeeze flaske vand til at fortynde blegemiddel venstre på pladen og samle så mange embryoner som muligt ved at dekantere blandingen i filteret. Vask embryoner tre til fire gange med vand, indtil blegemiddel lugt spredes. Fjern filteret fra apparatet, og vask det på en anden ren plade med vand.
Derefter dekanteres vandet fra den nye plade, som embryonerne er tændt. Brug fine hæcener til at vælge fem til 10 embryoner på 15 timer efter æglægning og placere dem på dobbeltsidet tape med dorsal side vender opad. Tilføj insektring saltvand til dissektion pool for at beskytte embryoner fra udsivning.
Brug en glasnål under et diseksekseksemroskop til at trække fosteret ud fra midtermembranen fra båndet på glasset, og pas på ikke at beskadige embryonets indvendige væv. Skær derefter gennem midterlinjen af et enkelt foster på dens overflade fra dens bageste til forreste ende. Vend epitelvævet fra midten og fastgør epidermal kant på overfladen af glasdiaset.
Brug et rør tilsluttet nål med en spids åbning på omkring 300 mikrometer til at aspirere eller blæse luft for at fjerne dorsale langsgående luftrørets kufferter samt eventuelle resterende indvolde. Brug 4% PFA og PBS til at fastgøre embryonerne i fem minutter ved stuetemperatur på en orbital shaker. Vask dem tre gange med PBS.
Plette embryoner med en mikroliter af anti peberrod peroxidase antistof konjugeret med Cyanine3 farvestof og 200 mikroliter af PBS i en time på orbital shaker. Og gentag vaskene i PBS. For at fylde injektionsmikropipetten skal den sættes ind i kapillærholderen.
Næste sted farvestof dias på scenen og bruge mikromanipulator til at placere den over diaset. Juster derefter scenen for at placere mikropipetten på farvestoffet. Farvestoffet opsamls i mikropipetten ved at indstille injektionstrykket til mellem 200 og 500 hektopascal, injektionstiden mellem 0,1 og 0,5 sekunder og kompensationstrykket til nul i fem minutter.
Når farvestoffet er opsamlet, fjernes farveskredsen, og prøven anbringes på mikroskopstadiet. Forøg derefter kompensationstrykket til et interval på 30 til 60 hektopascal, og sænk derefter mikropipetten ned i prøven. Brug den 10 gange objektive linse til at lokalisere embryonet og tilpasse mikropipetten med fosteret.
Skift objektivet til en vandnedsænkning 40 gange linse. Og nedsænke linsen i PBS. Brug fluorescensmikroskopi til at kontrollere den neuronale morfologi, der er kendetegnet ved anti-HRP Cy3, og fastgør injektionsstedet.
Når embryonet er i fokus ændre placeringen af mikropipetten at gøre blid kontakt med spidsen af axon af interesse. Brug derefter lys feltmikroskopi under injektionen for at se farvedråbe. Drop farvestoffet i højre abdominal hemisegment ved neuromuskulær krydset af aCC eller RP3 med enten DiD eller DiO.
Brug håndbetjeningen til at frigøre farvestoffet og fjerne mikropipetten. Gå derefter videre til det næste injektionssted. Prøven inkuberes i en time ved stuetemperatur på en orbitalshaser før billeddannelse.
Brug fine vicessper, fjern båndene fra glasdiaset. For at montere prøven skal du forberede en dækselsseddel med en lille mængde vakuumfedt i de fire hjørner. Forsigtigt placeret det på prøven, og sørg for at undgå luftbobler.
Tryk dækslet ned for at justere afstanden fra prøven, så der er arbejdsafstand mellem objektivets linse og diaset. Fjern eventuelt overskydende PBS med opgaveservietter. Luk helt kanterne af dækslet slip med neglelak.
Billede på 10 gange og 100 gange forstørrelse med en konfokal mikroskop og behandle billederne, med imageJ software. Denne protokol blev brugt til at tilbageskridt etiketten aCC motor neuron innervating muskel en og RP3 motor neuron innervating muskler seks og syv. Dendritiske grene fra ACC og RP3 motor neuroner viser omfattende overlapning.
Begge neuroner er bipolar, oprettelse af to forskellige populationer af dendritter. For at demonstrere den kvantitative kapacitet af denne metode blev det samlede antal dendrite-spidser talt med vild type og Dscam1-mutanter. Den ipsilateral dendrites af aCC er vist for den vilde type, men kun få ipsilateral dendritter blev observeret for Dscam1 mutant.
Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at størrelsen af farvestofdråbe er afgørende, hvilket er ca. 10 til 20 mikrometer. Test størrelsen på det dobbeltsidede bånd, og anvend den derefter på injektionsstedet. Ved hjælp af denne procedure kan vi drage fordel af DiD-sondens fotoskiftelige egenskab for at få superopløsningsbilleder af plasmamembranen.
På denne måde kan vi studere den ultra strukturelle karakterisering af de synaptiske membraner ved det neuromuskulære kryds. Vi gjorde det klik. Vi udførte fænotopypisk analyse af aCC-dendritterne i mutant stamme, og opdager, at en Dscam1-Dock-Pak injektion definerer stedet for dendrite udvækst i aCC.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
