Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering
Summary March 16th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne rapporten beskriver screening av ulike vaskemidler for å forberede den visuelle GPCR, rhodopsin, og dens kompleks med mini-Go. Biokjemiske metoder som karakteriserer kvaliteten på komplekset på forskjellige stadier under rensing er demonstrert. Denne protokollen kan generaliseres til andre membranproteinkomplekser for deres fremtidige strukturelle studier.
Transcript
Signaltransduksjon er et av de viktigste temaene innen biologisk og farmasøytisk forskning. Det krever membranproteiner for å overføre signaler til deres intracellulære signalpartnerprotein. Denne protokollen er utformet for å utføre en systematisk vaskemiddelscreening i utarbeidelsen av et signalkompleks som tar sikte på strukturbestemmelse.
Denne protokollen bruker allment tilgjengelige teknikker i et veletablert biologilaboratorium og utføres enkelt av nybegynnere i feltet. Vi besto av disse metodene for å finne den mest kritiske parameteren i utarbeidelsen av membranproteinkompleks. Til å begynne, tine 30 gram HEK293 GNT I-mangelfull celle pellet til romtemperatur og overføre den til et beger.
Tilsett 120 milliliter PBS-buffer som inneholder proteasehemmercocktail og homogen ved hjelp av en Dounce homogenisator eller en elektrisk homogenisator ved 13 000 O/min i 30 sekunder. Juster volumet til 150 milliliter med PBS-buffer. Tilsett forsiktig 10% DDM til de homogeniserte cellene for å gi en endelig konsentrasjon på 1,25% Rør på is i en time.
Etter solubilisering sentrifuger cellen lysate ved fire grader Celsius og 150 000 ganger G i 45 minutter for å fjerne uløselig avfall. Overfør supernatanten til en 500 ml flaske og tilsett 10 milliliter av 50% 1D4 immun-affinitet agarose harpiks. Bland forsiktig den solubiliserte cellelylat og harpiks i fire timer eller over natten ved fire grader Celsius for å tillate proteinbinding.
Last lysateharpiksblandingen til en åpen kolonne for å samle harpiksen. Vask harpiksen med 10 kolonnevolumer vaskebuffer A for å fjerne proteinforurensningen. Lukk ventilen og resuspend harpiksen med to kolonnevolumer buffer A.Neste, under svakt rødt lys tilstand, tilsett 9-cis Retinal til den resuspended harpiks til en endelig konsentrasjon på 50 mikromos.
Bland forsiktig ved fire grader Celsius i fire til 16 timer i mørket for Retinal binding. Deretter åpner du verdien og fjerner bufferen fra kolonnen. Vask harpiks med 20 kolonnevolumer buffer A, etterfulgt av 15 kolonnevolumer buffer B for å fjerne ubundne Retinal.
Bruk harpiksen på nytt i to kolonnevolumer av buffer B, og del deretter harpikssuspensjonen likt med 10 10 milliliter avhendingskolonner. Fjern bufferen fra de 10 kolonnene, og bruk deretter harpiksen på en milliliter buffer C for endring av vaskemiddel. Inkuber i en time på is.
Gjenta vasken og inkubasjonen i buffer C en gang til. Fjern bufferen fra kolonnene, og gjenopprett deretter harpiksen på 0,8 milliliter med elutionbuffer for hver kolonne. Bland forsiktig i to timer.
Samle elution fra hver kolonne i et rør. Bruk harpiksen på ny i 0,7 milliliter elutionbuffer for hver kolonne. Bland forsiktig i en time.
Samle elution fra hver kolonne i de samme rørene. I mørket, last det utsudede proteinet til kvarts cuvette. Mål spekteret av proteinprøven.
Belys proteinet direkte i cuvette i to minutter med lys passere gjennom 495 nanometer lang pass filter. Mål spekteret av den opplyste prøven. Utfør samme måling for alle proteinprøvene renset i de andre ni vaskemidler.
Både mørke og opplyste tilstander. Under normalt lys, for hver vaskemiddel tilstand forberede 100 mikroliter rhodopsin på 0,7 milligram per milliliter. Under svakt rødt lys, forberede 100 mikroliter av blanding av rhodopsin på 0,7 milligram per milliliter og mini-GO på 0,2 milligram per milliliter.
Supplere blandingen med en millimolar magnesiumklorid. Belys blandingen med lys fra et 495 nanometer langpassfilter og inkuber i 30 minutter. Overfør prøvene til de automatiske prøvehetskulene og plasser dem i prøveskuffen.
Programmer en metodefil for å automatisere sekvensielle SEC-kjøringer for hver prøve med auto-sampleren som laster inn 77 mikroliter av prøven til kolonnen og renseren som unnviker 25 milliliter SEC-buffer per kjøring. Registrer absorbansen ved 280 nanometer og 380 nanometer. Samle toppen fraksjoner av rhodopsin og rhodopsin-mini-GO kompleks på oppbevaring volum rundt 12,9 milliliter.
Analyser de venstre rhodopsinprøvene og toppfraksjonene av rhodopsin-mini-GO-kompleks på fire til 12% SDS denaturing gradient gels med Coomassie blå farging. Forbered en 200 mikroliter blanding av rhodopsin på ett milligram per milliliter og PNGase F ved 0,01 milligram per milliliter. Bland godt og inkuber på is over natten.
Forbered en 200 mikroliter blanding av rhodopsin på ett milligram per milliliter og Endo F1-13 ved 0,01 milligram per milliliter. Bland godt og inkuber på is over natten. Analyser fordøyelsesresultatet av SDS-Page og Coomassie blå farging.
I denne studien ga småskala renseoppsett tilstrekkelig protein for videre analyser. Ultrafiolett synlig spektra av rhodopsin viser den mørke tilstanden 9-cis Retinal bundet rhodopsin i blå kurver. Etter belysning er 9-cis Retinal deproteinert og isomerizes i alle trans-Retinal.
Forholdet mellom absorbemidler ved 280 nanometer over absorbekter 488 nanometer og absorbemidler ved 280 nanometer over absorbemidler ved 380 nanometer skildrer stabiliteten til rhodopsin renset i hvert vaskemiddel. Størrelse eksklusjon kromatografi profiler av rhodopsin og rhodopsin-mini-GO kompleks renset i 10 forskjellige vaskemidler er vist her. Profilen til standardmarkørproteinene vises som overlegg sammen med DDM-prøven.
Tolkningen av toppprofilene er vist for DMNG med det ideelle scenariet sett for DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 og OGNG. Den forstørrede profilen til OGNG-prøven viser både rhodopsin og rhodopsin-mini-GO-komplekset som er unnsluppet rundt samme retensjonsvolum. SDS-Page-analysen av rhodopsin og SEC rensede prøver av rhodopsin-mini-GO-komplekset vises her.
Denne figuren viser SDS-sideanalysen av rhodopsin deglykosylering med Endo F1- og PNGase F-enzymer. Det er avgjørende å utføre vaskemiddelscreening på en systematisk måte, slik at virkningen av hvert enkelt vaskemiddel tydelig kan sammenlignes uten tvetydighet. For protein av ulike mengder kan termisk skiftanalyse også brukes til å studere virkningen av vaskemiddel på proteinstabilitet.
Takket være denne metoden er vi i stand til å forberede stabilt proteinkompleks og til slutt løse krystallstrukturen som går tapt i geomontering. Det ga viktig innsikt i GPCR-G protein interaksjon spesifisitet.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE