Journal
/
/
LarvaSPA, en metode for montering drosophila larve for langsiktig time-lapse imaging
JoVE Journal
Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Biology
LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

LarvaSPA, en metode for montering drosophila larve for langsiktig time-lapse imaging

7,281 Views

08:55 min

February 27, 2020

DOI:

08:55 min
February 27, 2020

7 Views
,

Transcript

Automatically generated

LarvaSPA er den første metoden som muliggjør kontinuerlig levende avbildning av intakte drosophila larver i mer enn 10 timer med høy temporal og romlig oppløsning. Denne metoden brukes til å avsløre dynamiske cellulære prosesser av larver perifere sensoriske nevroner og for å studere mange andre cellulære prosesser som skjer i nærheten av larvekroppsveggen. Denne metoden er enkel å bruke og har mindre begrensning på larvestørrelse.

Seks til ni larver kan monteres i bildekammeret samtidig, noe som gjør eksperimentet mulig. Bildekammeret ved PDMS cuboids kan produseres til en minimal kostnad og kan brukes om igjen. Denne metoden er spesielt nyttig for å studere mekanismer for dendrittutvikling og dendrittdegenerasjon ved hjelp av drosophila larve dendrittiske autorisasjonsnevroner.

Å kunne bilde det samme nevronen i timevis kan avsløre hvor langsiktige globale endringer av dendrittiske mønstre oppstår fra kortsiktig atferd på individgrensnivå. Ved hjelp av PDMS cuboids som samsvarer med størrelsen på larver vil øke suksessraten for immobiliserende larver. Finn flere nyttige kassetter i feilsøkingsdelen.

Etter å ha konstruert en aluminiumsblokk fra et maskinverksted, forsegle bunnen av metallrammen ved hjelp av en lang dekselslipp med UV-lim. Herd UV-ledetråden ved hjelp av en håndholdt UV-lampe i 30 sekunder. Fest lag med emballasjetape til den indre overflaten av en rektangulær petriskål eller rund cellekulturplate.

Bruk ett lag for andre in-star larver, to lag for tidlig tredje in-star larver, eller tre lag for sen tredje in-star larver. Skjær båndet i turer av spesifikk bredde med et barberblad, 1,5 millimeter for ett lagtape og to millimeter for to lag eller tre lag tape. La minst en fem millimeter mellomrom mellom de to strimler.

Fjern tapelagene som dekker plassen. Fjern støv fra den indre overflaten av platen ved hjelp av klebrig tape. Etter det er formen klar til bruk.

For å forberede PDMS-blandingen, bland syv gram PDMS-base i 0,7 gram herdingsmiddel grundig i en liten beholder. Plasser beholderen i en vakuumdesiccator i minst 15 minutter for å fjerne luft fra blandingen. Hell sakte ca 5,5 gram PDMS-blanding på formen for å nå en tykkelse på en til to millimeter.

Plasser PDMS-blandingen i vakuumdesiccatoren igjen i minst 15 minutter for å fjerne gjenværende luftbobler fra blandingen. Bryt de siste boblene med en pipettespiss. Herd PDMS på en flat overflate i en varmeinkubator ved 65 grader Celsius i to timer.

Deretter bruker du et barberblad for å løsne de herdede PDMS langs kanten av formen og løsne den fra formen. Oppbevar PDMS mellom to stykker stor klebrig tape ved romtemperatur. For tidlig og sen tredje in-star larver, kutt PDMS i åtte med to og en millimeter cuboids ved å plassere sporet skapt av båndstripen i midten av langsiden av cuboid.

For andre in-star larver, kutt cuboid til åtte med en etter en millimeter. For å forberede topdekselet slip for montering, velg seks PDMS cuboids med spor som samsvarer med størrelsene på larver. Fjern støv fra overflaten av PDMS med klebrig tape.

Fest fire stykker dobbeltsidig tape på størrelse med 12 med fem millimeter på en lang dekselslip på 22 med 50 millimeter for å fikse PDMS cuboids senere. Juster mellomrommene mellom de to bitene med dobbeltsidig tape til det samme som bredden på PDMS-sporet. Påfør en liten dråpe UV lim inn i sporet av hver PDMS cuboid og legg til seks små dråper UV lim inn i mellomrommet mellom de dobbeltsidige båndene på dekselet slip.

For å forberede larver for montering, bruk et par tang, rengjør larver i vann for å fjerne mat fra kroppsoverflaten. Legg de rene larver på et lite stykke fuktet vevspapir i en liten petriskål uten lokk og legg den lille petriskålen i en stor petriskål som inneholder et stykke tørt vevpapir. I en kjemisk hette, bruk en plastoverføringspipette til å påføre 160 til 240 mikroliter isofluran på det tørre vevspapiret og lukk lokket på den store petriskålen.

Vent to til tre minutter mens du overvåker larver. Når munnkrokene slutter å bevege seg, ta ut larver fra den store petriskålen. Plasser de immobiliserte larver på UV-limet mellom de dobbeltsidige båndene på dekselslipp med den dorsale skjellaget vendt mot dekselslipp.

Dekk hver larve med en PDMS-blokk og monter stammen på larven inn i sporet på PDMS. La hodet og halen på larven utenfor PDMS-sporet. Unngå å blokkere larvens spirakler ved limet.

Trykk ned på endene av PDMS-blokken på dobbeltsidig tape uten å bruke kraft på sporet. Trekk forsiktig på larvens hale for å flate skjellaget under PDMS. Bruk vernebriller og bruk en håndholdt UV-lampe til å kurere UV-limet i fire minutter på den høye innstillingen.

Snu dekselet skli opp ned og bruk UV-lampen til å kurere UV-limet i ytterligere fire minutter. Legg et lite stykke linsepapir med en størrelse på 15 med 30 millimeter nederst i bildekammeret. Fukt papiret med 20 til 30 mikroliter vann.

Plasser dekselet slip på kammeret slik at larvene vender mot innsiden av kammeret. Bruk UV-limet til å feste begge ender av dekselet slip til metalloverflaten. Den dorsale siden av larver er klar for avbildning under et konfokalt mikroskop.

Etter bildebehandling fjerner du oljen på topdekselet ved hjelp av linsepapir. Ta av toppdekselet fra metallrammen ved å skjære inn i rommet mellom dekkslipp og metallrammen med et barberblad. Bildekammeret er klart for gjenbruk.

Løsne PDMS cuboids fra toppdekselet slip med tang. Rull PDMS cuboids på klebrig tape for å fjerne limrester og støv. PDMS cuboids er klare for gjenbruk.

I denne protokollen ble drosophila larver immobilisert i mer enn 10 timer for kontinuerlig avbildning. Denne figuren viser seks sent tredje in-star larver montert i kammeret. Larvenes stammer ble fikset mens deres hoder og haler var fri til å bevege seg.

Her demonstrerer vi anvendelsen av LarvaSPA i å studere nevronal dendrittdynamikk og dendrittdegenerasjon ved hjelp av klasse fire DA-nevroner som modell. For å lykkes immobilisere larver ved hjelp av denne metoden, er det viktig å slutte å utsette larver for isofluran når munnkrokene slutter å bevege seg og kurere UV-limet før larver våkner helt opp. For å studere dendrittdegenerasjon og regenerering, kan laserskade utføres når larver immobiliseres i bildekammeret.

LarvaSPA har hjulpet oss å forstå hvordan dynamiske voksende dendritter ikke klarer å innervate epidermale celler som i levercelleprooglykaner og hvordan fosfadylserin eksponeres på degenererende dendritter etter laserskade. Beskytt øynene med vernebriller mens du bruker UV-lampen. Slå ut larver ved hjelp av isofluran bør utføres i en røykhette.

Summary

Automatically generated

Denne protokollen beskriver en metode for montering av Drosophila larver for å oppnå mer enn 10 timer uavbrutt time-lapse imaging hos intakte levende dyr. Denne metoden kan brukes til å bilde mange biologiske prosesser nær larval kroppen veggen.

Read Article