Login processing...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Använda en extracellulär Flux-analysator för att mäta förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Journal (Biochemistry)

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Journal (Biochemistry)

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Click here for the English version

Använda en extracellulär Flux-analysator för att mäta förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet

Article DOI: 10.3791/60815-v

January 22nd, 2020 •

Melanie Balbach¹, Jochen Buck¹, Lonny R. Levin¹

¹Department of Pharmacology, Weill Cornell Medical College

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

January 22nd, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi beskriver tillämpningen av en extracellulär Flux Analyzer för att övervaka realtids förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet.

Transcript

Detta protokoll kan användas för att tillämpa en extracellulär flux analysator för att övervaka förändringar i energimetabolism under spermier kapacitering. Vi utvecklade detta protokoll för att jämföra förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering i realtid mellan icke-kapacierade och kapacierade mus spermier. Dagen före analysen tar du bort sensorpatronen från en extracellulär fluxanalyssats och placerar patronen upp och ned bredvid bruksplattan.

Fyll en lösning reservoar med 25 milliliter dubbel destillerat vatten och tillsätt 200 mikroliter vatten till varje brunn av verktyget plattan, sedan placera sensorn patronen tillbaka i verktyget plattan. Placera plattan i en 37 grader Celsius icke-koldioxid inkubator. Därefter alikvot 25 milliliter extracellulära flux analysator calibrant i en 50 milliliter koniska röret och placera röret i 37 grader Celsius icke-koldioxid inkubator.

För att förbereda ConA belagda mikroplattor, lös 2,5 milligram ConA i fem milliliter dubbel destillerat vatten och använda en flerkanalig pipett för att fylla varje brunn av en extracellulär flux analysator 96-brunnsplatta med 50 mikroliter av ConA-lösningen, lämna sedan locket öppet för att låta plattan torka över natten. För att förbereda spermabufferten, värm 250 milliliter extracellulära fluxanalysator TYH buffert till 37 grader Celsius och justera pH till 7,4. På dagen för analysen, byt ut vattnet i varje brunn av bruksplåten med 200 mikroliter av XF calibrant per brunn och placera plattan tillbaka i icke-koldioxidinkubatorn i minst en timme.

Om du vill generera en vågmall slår du på den extracellulära fluxanalysatorn. Medan temperaturen stabiliseras till 37 grader Celsius, öppna vågprogramvaran och öppna en tom mall. Under fliken gruppdefinitioner definierar du analysmediet som TYH och celltypen som musspermier, vilket gör att injektionsstrategierna och förbehandlingarna blir tomma.

Skapa olika grupper för varje analysvillkor och öppna plattkartan för att tilldela varje grupp till specifika brunnar. Under fliken protokoll, unhighlight jämvikt, lägga till var och en av fyra olika mätcykler, välj respektive port och redigera mätdetaljerna så att måttet efter injektionen markeras, sedan spara assay-mallen, fyll i projektsammanfattningen och spara resultaten. Före skörden av spermierna, prewarm 50 milliliter AV TYH buffert vid 37 grader Celsius.

Efter skörd caudas från vuxna handjur möss, placera varje cauda i 500 mikroliter av den förvuppvade TYH buffert i enskilda brunnar av en 24-brunns platta. Använd forceps för att immobilisera varje cauda individuellt i botten av varje brunn och snabbt göra fem till sju små snitt i varje vävnad med hjälp av fjäder sax. När alla caudas har incised, omedelbart placera plattan i icke-koldioxid inkubatorn så att spermierna att skingra i 15 minuter.

För att ladda sensorkassetten, ta bort locket från sensorkassetten och rikta in bokstaven för respektive portladdningsguide med patronens övre vänstra hörn. Håll portlastningsguiden på plats, sätt in pipettspetsarna vertikalt i portens lastningsguidehål i port A och injicera 20 mikroliter AV TYH-buffert i varje kolumn. För port B, injicera 22 mikroliter av TYH buffert i kolumnerna en till fyra, 22 mikroliter på 500 millimolar 2-deoxyglucose i kolumner fem till åtta, och 25 mikroliter av fem mikromolar antimycin A rotenon i kolumner nio till 12.

För port C, injicera 25 mikroliter av TYH buffert i varje kolumn med udda siffror och 25 mikroliter på 10 millimolar av dibutyryl-cykliska AMP 500 mikromolar IBMX i varje kolumn med jämna nummer, sedan placera sensorn patronen med en kalibreringsplatta i extracellulära flux analysatorn och starta analysen. Kalibreringen tar 10 till 15 minuter. För att förbereda spermier plattor, tillsätt tre milliliter av tre milligram per milliliter nötkreatur serum albumin i TYH buffert till var och en av tre fem milliliter centrifugrör.

Därefter pool två brunnar av spermier i var och en av tre 1,5 milliliter centrifugrör. Efter räkning, späda spermierna till en två gånger 10 till de sju spermier per milliliter koncentration per prov i färska TYH kompletteras med bovin serum albumin. Sediment sperma genom centrifugering och resuspend spermier pellets i en milliliter av TYH buffert.

Centrifugera spermierna igen och ta bort supernatanterna noga med att inte störa pellets. Överför varje spermiefjädring i ett av de beredda fem millilitercentrifugerören och tillsätt 180 mikroliter av TYH-buffert i varje hörnväl av en ConA-belagd platta. Lägg till 180 mikroliter av spermier i varje tom brunn av ConA-belagd platta och centrifug plattan två gånger roterande plattan 180 grader mellan centrifugering, sedan placera kalibreringsplattan med spermierna platta och fortsätta analysen.

I detta representativa experiment var spermier kapaciterade i närvaro av glukos som enda energi substrat och 2-deoxyglucose och antimycin och rotenon som de farmakologiska modulators. Pilen indikerar induktion av kapacitation. I närvaro av glukos, capacitation åtföljdes av en sjufaldig ökning av extracellulära försurningshastighet som hämmas genom att blockera glykolys med 2-deoxyglucose.

Kapaciterade spermier visat en 20-faldig ökning av syreförbrukning jämfört med icke-kapaciterade spermier som visar att mus spermier förbättra både glykolys och oxidativ fosforylering för att stödja den ökande efterfrågan på energi under kapacitering. Ökningen av den extracellulära försurningsgraden under sperma kapacitation påverkas inte av de oxidativa fosforyleringshämmare antimycin A och rotenon som visar att förändringen i denna takt huvudsakligen drivs av väteutsläpp från glykolys. Ökningen av syreförbrukningshastigheten blockeras dock av antimycin A och rotenon samt av 2-deoxyglucose avslöjar att ökningen av OXPHOS under sperma kapalylering är beroende av glykolytisk aktivitet.

Energikällan och farmakologiska aktivatorer och inhibitorer kan varieras beroende på målet med försöket och upp till 12 olika förhållanden kan mätas parallellt. Protokollet kan lätt anpassas till andra arter som människa eller nötkreatur där förändringarna i energiomsättningen under kapajakation är lika gåtfulla.

X

Simple Hit Counter