A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Intra-arteriel levering af neurale stamceller til rotte og mus hjernen: Ansøgning om cerebral iskæmi
Chapters
Summary June 26th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En metode til levering af neurale stamceller, der kan tilpasses til injektion af opløsninger eller suspensioner, gennem den fælles kartepander arterie (mus) eller ekstern carotis arterie (rotte) efter iskæmisk slagtilfælde er rapporteret. Indsprøjtede celler er fordelt bredt i hele hjernen parenkym og kan påvises op til 30 d efter fødslen.
Transcript
Slagtilfælde er den hyppigste årsag til dødelighed og handicap på verdensplan. Selv om trombolyse og kirurgisk fjernelse af cerebral vaskulær okklusion kan udføres i udvalgte patienter, der er stadig et presserende behov for effektive behandlinger mod slagtilfælde. Her demonstrerer vi en kateterbaseret, intra-arteriel levering af stamceller til den iskæmiske halvkugle som et potentielt regime til slagtilfælde terapi.
Først introducerer vi, hvordan du forbereder injektionskateteret og kirurgiske kroge. Vi designede to typer injektionskatetre til intra-arteriel injektion. Design et bruges til injektion af en opløsning eller suspension, der ikke kræver skylning af røret.
Design to tillader injektion af neurale stamceller, efterfulgt af en flush af den døde volumen til at levere den fulde volumen. For at opbygge et sæt injektion katetre, skal du 26 gauge og 20 gauge nåle, en 10 til 15 centimeter længde af MRE 25 kateter og tre centimeter længde af MRE 50 og MRE 10 katetre. Skær både nål tips og polere metal ende på sandpapir at genåbne røret og glatte kanterne og derefter skylles med destilleret vand til at rense ud boring og vaske snavs.
Figuren viser en lukket ende af en 20 gauge nål efter klipning fra nålen spidsen, som genåbnes med en glat boring efter polering. Under et mikroskop, indsætte 20 gauge nål i slutningen af MRE 50 slange. Bøj 26 gauge nålen og derefter trænge ind i slangen under enden af de 20 gauge nål spids.
Fastgør 26 gauge nålen med super lim. Derefter integrere de to nålenav og slange og epoxy at opbygge en solid blok til at øge styrken. Du skal også bruge tre kirurgiske kroge til at holde vævet i position for bedre eksponering af de kirurgiske steder.
Skær en halvanden til to centimeter lang nåleskaksel fra en 27 gauge nål og polere begge ender på sandpapir indtil kedelig. Brug en lille hæmostatisk klemme til at bøje akslen i en krog i den ene ende og en ringformet i den anden ende. Sæt en 10 til 15 centimeter lang MRE 25 kateter gennem ringen og fastgør med klart kirurgisk tape.
Lav to kroge mere ved hjælp af samme metode. Krogene og katetersystemet skal lægges i blød natten over i halvfjerds procent ethanol til sterilisation. Alle procedurer, der involverer forsøgspersoner, blev godkendt af Udvalget for Institutionel Pleje og Anvendelse ved University of Kentucky.
Vi bruger ENT embryonale mus hjerne til kultur GFP, positive neurale stamceller. GFP positive embryoner kan let visualiseres i FITC-kanalen på et fluorescerende mikroskop. Mens vilde-type embryoner viser ingen fluorescens ved hjælp af samme eksponering.
Den automatiske opsprang af embryoner af vildtypen er kun synlig, når eksponeringstiden øges 100 gange. Embryonale cortex indsamles og bruges til at etablere neurale stamceller kulturer efter producentens protokol. Disse neurale stamceller kan danne neurosfærer og kan være passage over 10 generationer, og de kan differentiere i glia er neuroner.
Panel af embryonale stamcellemarkører såsom nanog, SSEA1, Oct4 og Sox3 kan bruges til at identificere stamcelleegenskaberne, mens de er i neurosfærer. Neurosfærer blev dyrket i medierne, efter producentens protokol og brug mellem passager tre og fem for neurale stamceller levering. Iskæmisk slagtilfælde blev induceret i venstre halvkugle for både mus og rotter, ved hjælp af en glødetråd baseret, midten cerebral arterie okklusion, MCAO med nogle ændringer afhængigt af arten.
I mus indsættes glødetråden gennem den almindelige halspulsåre, CCA og avancerede ind i den interne halspulsåre, ICA. Mens der i rotter, glødetråden er indført gennem den eksterne halspulsåren, ECA i ICA på grund af de større arbejdsplads. Her demonstrerer vi museoperationen.
Efter at have lavet en midterlinje snit langs halsen, adskille de underliggende væv ved hjælp af stump dissektion. Brug de tre mikrokirurgiske kroge lavet af 27-gauge nål aksler for at opnå et bedre synsfelt. Den sorte firkant angiver det kirurgiske område for det næste trin.
Muskellaget over venstre CCA er omhyggeligt åben for at eksponere venstre CCA og vagus nerve. Følg CCA, indtil du når og identificerer bifurcation. Der bør udvises forsigtighed for ikke at strække, fortrænge eller presse denne CCA eller vagus nerve.
Åbn omhyggeligt det klare bindevæv, der dækker CCA og vagus nerve. Frigør pladsen under denne CCA med en spids af snævler og isolere CCA stilken så meget som muligt. Tråd en dobbelt-strandede seks O flettet nylon kirurgisk sutur under CCA.
Skær det midterste punkt til at forlade til suturer underliggende CCA. Placer en anden nylon sutur under CCA. Bind en slipknot på den øverste sutur, holde den løs.
Adsk dem to nederste suturer. Bind en slip knude med den midterste sutur, holde det løs for nu. Bind en kirurgs knude med en lavere sutur og flyt den så vidt muligt til den proksimale ende.
Trim ned sutur ender. Yderligere udsætte CCA ud over bifurcation. Skub den øverste løse slipknot til bifurcation og stram den for at forhindre tilbageløb af blod.
Læg silicium gummi belagt 70 nylon MCAO sutur ved siden af CCA. Brug mikro saks, skære et lille snit på CCA, ved siden af den nederste knude. Sæt spidsen af MCAO-suturen ind i CCA gennem dette snit og fremføring den til den øverste knude.
Juster positionen af den midterste knude og stram den, indtil den kan holde MCAO-suturen på plads. Stram ikke knuden for meget. Slip den øverste knude, men lav en anden løs slip knude på samme sted.
Fremrykning af MCAO-suturen ind i ICA'en. Bekræft, at MCAO-suturen passerer bifurcationen ind i ICA' en. Stien til suturen skal være relativt lige, ind i dybere ind i vævet, som det forskud.
Kontroller sølvmarkøren på suturenden. Sørg for, at den når bifurcation. Kontroller retningen af MCAO-suturen igen.
Juster øvre og midterste knuder for at sikre, at der ikke lækker blod. Yderligere frem MCAO sutur, stramme de to øverste knob for at sikre MCAO sutur på plads. Start optaget tid til en times iskæmi.
Efter en times iskæmi bedøver vi dyret og genåbner hudsåret. Eksponere det kirurgiske område. Find øvre og midterste slipknots.
Slip forsigtigt den øverste knude. Træk forsigtigt MCAO-suturen ud, indtil den hvide silikonegummidel når den midterste knude. Stram den øverste knude for at holde MCAO-suturen på plads for at undgå blødning.
Slip forsigtigt den midterste slipknot. Træk MCAO-suturen ud, indtil dens ende passerer den øverste knude. Stram den øverste knude.
Placer den midterste slipknot lige over snittet på CCA. Stram den midterste slipknot. Fjern den øverste knude.
Trim sutur ender af den midterste knude. Luk hudsåret og lad dyret komme sig. Baseret på vores erfaring, neurale stamceller sikkert injiceres gennem denne arteriel rute mellem en og tre dage efter slagtilfælde.
Igen, der er mindre variationer mellem mus og rotte operationer for neurale stamceller injektion. Og her demonstrerer vi museoperationen. På dag tre efter slagtilfælde, bedøve dyret, genåbne såret og re-eksponere CCA.
Læg en dobbeltstrenget kirurgisk sutur under CCA og skær den midtpunkt for at få to suturer. Placer de to suturer korrekt. Lav en slipknot med den øverste sutur.
Placer den lige under bifurcation. Stram den øverste slipknot. Lav en anden slipknot med den midterste sutur.
Skær et lille snit lige over den trimmede knude tilbage fra slagtilfælde kirurgi. Trim spidsen af MRE 10 kateteret med en vinkel på ca. 45 grader. Brug denne skarpe ende til at indtaste snittet på CCA.
Sørg for at justere indgangsvinklen og den kraft, der bruges til at indsætte kateteret, korrekt. Ellers må kateteret ikke komme ind i CCA eller punktere det. Sæt kateteret i, og fremføring, indtil spidsen når den øverste knude.
Stram den midterste slipknot at holde kateteret på plads og sikre ingen blodforbindelse. Slip den øverste knude. Lav en slip knude med den øverste sutur.
Juster kateterets vinkel i CCA og begge knuders positioner, indtil der er synlig en hurtig tilbagestrømning af blod, hvilket indikerer en vellykket kommunikation mellem kateteret og CCA-flowet. Start sprøjtepumpen. Blodet i kateteret skylles tilbage til CCA.
Afslut injektionen efter fem minutter. Ligte den øverste knude. Slip den midterste knude og træk kateteret tilbage.
Ligate den midterste knude. Trim alle knuder. Luk såret og lad dyret komme sig.
Efter intra-arteriel injektion, GFP mærket neurale stamceller er for det meste findes i den ipsilaterale halvkugle. Her viser vi fordelingen i hippocampal dentate gyrus på en dag efter injektion. I den ipsilaterale halvkugle, nogle af de GFP positive neurale stamceller lokaliseret i cortex og striatum, udtrykke dobbelt cort, en markør for umodne neuroner.
Disse er repræsentative billeder fra fingeret og slagtilfælde dyr med eller uden neurale stamceller injektion på syv dage efter injektion. 30 dage efter fødslen kan der kun registreres mindre automatisk fluorescens via FITC-kanalen hos de dyr, der modtager injektion af køretøjet. Mens der i stamceller injicerede dyr, GFP mærket neurale stamceller kan findes i den skadede hjerne med udtryk for forskellige celle markører som gleo markør GFP eller neuronal markør tujuan.
De hvide pile i hvert billede indikerer neurale stamceller, der udtrykker henholdsvis GFP eller tujuanmarkører. Afslutningsvis, intra-arteriel injektion er en mulig metode til levering af neurale stamceller til slagtilfælde terapi. Neurale stamceller kan overleve og differentiere i forskellige celletyper i den skadede hjerne.
Og endelig, den intra-arteriel injektion metode indført her kan også bruges til levering af løsninger og suspensioner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
