测量小核苷酸基质的多核苷酸磷酸化的非放射性测定

该方法可以通过一种特殊的多核苷酸激酶来回答有关DNA或RNA分子五主要端磷酸化的关键问题。该技术的主要优点是具有检测DNA和RNA基质中非常小变化的分辨率。首先准备RNA酶激酶反应。

对于每次反应，结合一个微升的500纳米摩尔RNA基板。8.3 微升 130 纳米摩尔最后一个， GRC 三和 0.2 微升 5 毫摩尔 EDTA.将热块设置为 37 摄氏度。

然后将浓度序列中的 ATP 子库存的 0.5 微升与一个 RNA 酶混合物混合，将反应放在热块上。继续混合反应，并每隔十秒钟将其放置在热块上。在热块上孵育60分钟后，用10微升尿素装载染料将每次反应都淬火。

立即执行下游分析，或将反应储存在负 20 摄氏度，以在以后进行分析。要准备 15% 变性丙烯酰胺凝胶溶液，请将 22.5 毫升预混合 40%29 与一个丙烯酰胺/二丙烯酰胺溶液混合。六毫升的十个 x TBE 。

28.8克尿素。和RNase无水总体积为59毫升。然后轻轻搅拌溶液。

在微波炉中加热溶液20秒。搅拌它，并立即返回到微波炉再20秒。轻轻搅拌溶液，直到尿素完全溶解。

将玻璃烧杯放入浅水浴中，含冷水五分钟，确保玻璃烧杯周围的冷水水平高于玻璃烧杯内溶液的水平。当溶液冷却时，使用0.2 2微米一次性过滤装置过滤并去气，以去除颗粒物和微气泡。用肥皂和水清洗短而长的玻璃板，然后用95%乙醇喷洒每个盘子，擦拭玻璃以去除任何水分。

将长板放在盒子顶部，将其从工作台顶部提升。然后沿板的长边放置 0.4 毫米的分位器。将短板放在长板的顶部，确保短板、长板和垫片的边缘对齐。

然后用三个均匀的金属夹夹夹住每一侧。将 24 微升 TEMED 添加到丙烯酰胺溶液中并混合。然后加入 600 微升 10% APS，立即将溶液倒在玻璃板之间。

在玻璃板三明治之间浇灌丙烯酰胺溶液可能非常具有挑战性。为避免气泡，在浇注溶液时点按玻璃板三明治。小心地在玻璃板三明治的顶部添加一个干净的 32 井梳子。

使丙烯酰胺聚合30分钟。要运行凝胶，请将热块设置为 75 摄氏度。拆下金属夹。

彻底清洗和干燥玻璃板三明治。将板夹层和凝胶装置放置，使短板朝前，通过将 100 毫升 10 X TBE 与 1.9 升 RNase 无水相结合，准备 0.5 X TBE 运行缓冲液。将 600 毫升的运行缓冲液添加到仪器的上部和下腔。

轻轻地从凝胶上取下梳子，然后用注射器彻底冲洗孔。以 50 瓦的功率预运行凝胶 30 分钟。然后再次冲洗井。

后旋转淬火反应，并在75摄氏度孵育三分钟。重复脉冲旋转，立即将每个样品的 10 微升加载到凝胶上。然后在50瓦下运行凝胶三小时。

运行完成后，关闭电源并排空设备上腔。清洗和干燥玻璃板三明治的外侧。然后用铝箔盖住它，然后转移到激光扫描仪进行成像。

将玻璃板三明治安装到激光扫描仪的舞台上。为凝胶设置所需地板的激发和发射波长并成像凝胶。此处显示的是 ATP 滴定中具有代表性的成功变性凝胶，其固定量为最后一个 GRC 三复合体。

酶的加入导致最后一个中化RNA裂解的糖精化SAC2两个RNA基质，导致一个定义的RNA片段。加入ATP后，C2 RNA片段由GrC3 PNK磷酸化。为了可视化C2 RNA片段的磷酸化，针对ATP浓度绘制了未磷酸化和磷酸化C2RNA的相对量。

我们代表不成功的变性凝胶显示在这里。21核苷酸RNA基质含有降解产物，与磷酸化产物重叠，无法准确量化磷酸化。相比之下，最短的RNA降解产物可以成功分析，因为凝胶的这一区域不包含任何额外的RNA物种，这妨碍了其磷酸化对应物的精确定量。

尝试此协议时，要记住的最重要的事情是冲洗凝胶的孔，以确保样品的均匀加载。按照这个程序，可以进行RNA周转实验。为了测量RNA降解率，磷酸化通常标志着RNA降解的开始。

该技术为回答有关多核苷酸激酶的活动特异性和动力学的详细问题铺平了道路。