Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Deze methode kan antwoord geven op belangrijke vragen over de fosforylatie van het vijfste hoofdeinde van DNA- of RNA-moleculen door een speciale klasse van enzymen die bekend staan als polynucleotide kinase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de resolutie heeft om zeer kleine veranderingen in DNA en RNA substraten te detecteren. Begin met het voorbereiden van de RNA enzym kinase reacties.

Combineer voor elke reactie één microliter van 500 nanomolar RNA-substraat. 8,3 microliter van 130 nanomolar laatste, GRC drie en 0,2 microliter van vijf millimolar EDTA. Stel het hitteblok in op 37 graden Celsius.

Meng vervolgens 0,5 microliter van een ATP-subvoorraad uit de concentratiereeks met één RNA-enzymmengsel en plaats de reactie op het warmteblok. Blijf de reacties mengen en plaats ze met tussenpozen van tien seconden op het warmteblok. Na een incubatie van 60 minuten op het warmteblok, blus elke reactie door het te spiking met 10 microliters van ureum ladingkleurstof.

Voer onmiddellijk downstream-analyse uit of bewaar de reacties op negatieve 20 graden Celsius die op een later tijdstip moeten worden geanalyseerd. Om een 15% denaturering acrylamide gel oplossing voor te bereiden, combineer 22,5 milliliter voorgemixte 40%29 tot een acrylamide/bis acrylamide oplossing. Zes milliliter van tien x TBE.

28,8 gram ureum. En RNase vrij water tot een totaal volume van 59 milliliter. Roer vervolgens voorzichtig de oplossing.

Verwarm de oplossing gedurende 20 seconden in de magnetron. Roer het en onmiddellijk terug naar de magnetron voor nog eens 20 seconden. Roer de oplossing voorzichtig door tot de ureum volledig is opgelost.

Plaats het glazen bekerglas in een ondiep waterbad, met koud water gedurende vijf minuten, ervoor te zorgen dat het niveau van koud water rond het glazen bekerglas is boven het niveau van de oplossing in het glazen bekerglas. Wanneer de oplossing koel is, filter en ontgas het met een 0.2 twee micrometer wegwerpfiltratie-eenheid om deeltjes en microscopische luchtbellen te verwijderen. Was een korte en lange glasplaat met zeep en water en spuit vervolgens elke plaat met 95% ethanol en veeg het glas af om vocht te verwijderen.

Verhoog de lange plaat van de bank door het op een doos te plaatsen. Plaats vervolgens 0,4 millimeter afstandhouders langs de lange randen van de plaat. Leg de korte plaat op de lange plaat, zorg ervoor dat de randen van de korte plaat, lange plaat en afstandhouders zijn uitgelijnd.

Klem vervolgens elke kant met drie gelijkmatig verdeelde metalen klemmen. Voeg 24 microliter TEMED toe aan de acrylamideoplossing en meng het. Voeg vervolgens 600 microliter van 10% APS toe en giet de oplossing onmiddellijk tussen de glasplaten.

Het gieten van de acrylamide oplossing tussen de glasplaat sandwich kan echt een uitdaging zijn. Om luchtbellen te voorkomen, tik je op de sandwich van de glasplaat terwijl je je oplossing giet. Voeg voorzichtig een schone 32-well kam aan de bovenkant van de glazen plaat sandwich.

En laat de acrylamide 30 minuten polymeriseren. Om de gel te laten draaien, zet je het hitteblok op 75 graden Celsius. Verwijder de metalen klemmen.

En grondig wassen en drogen van de glazen plaat sandwich. Plaats de plaatsandwich en het gelapparaat met de korte plaat naar voren gericht en bereid 0,5 X TBE loopbuffer door 100 milliliter van 10 X TBE te combineren met 1,9 liter RNase vrij water. Voeg 600 milliliter van de loopbuffer toe aan de boven- en onderkamers van het apparaat.

Verwijder voorzichtig de kam uit de gel en spoel de putten grondig af met een spuit. Pre-run de gel op 50 Watt gedurende 30 minuten. Spoel vervolgens de putten opnieuw.

Post spin de quench reacties en broeden ze op 75 graden Celsius gedurende drie minuten. Herhaal de pulsspin en laad onmiddellijk 10 microliter van elk monster op de gel. Dan draait de gel voor drie uur op 50 Watt.

Wanneer de run is voltooid, schakelt u de voeding uit en laat u de bovenste kamer van het apparaat uitlekken. Was en droog de buitenkant van de glazen plaat sandwich. Bedek het vervolgens met folie en breng het over naar een laserscanner voor beeldvorming.

Monteer de sandwich van de glasplaat op het podium van de laserscanner. Stel de excitatie en emissiegolflengten in voor de gewenste vloer voor en beeld de gel. Hier getoond is een representatieve succesvolle denaturerende gel van een titratie van ATP met een vaste hoeveelheid laatste GRC drie complex.

Toevoeging van enzym resulteerde in de laatste bemiddelde RNA decolleté van de Saccharomyces cerevisiae zijn twee RNA substraat, wat leidt tot een gedefinieerd RNA fragment. Na toevoeging van ATP werd het C2 RNA-fragment gefossyleerd door GrC3 PNK. Om de fosforylatie van het C2 RNA-fragment te visualiseren, werd de relatieve hoeveelheid niet-phosphorylated en fosforylated C2 RNA uitgezet tegen de ATP-concentratie.

Onze representatieve niet-gesuccesvolle deaturering gel wordt hier getoond. Het 21 nucleotide RNA-substraat bevatte afbraakproducten, die overlappen met het fosforyleerde product en het onmogelijk maakten om fosforylatie nauwkeurig te kwantificeren. Het kortste RNA-afbraakproduct kon daarentegen met succes worden geanalyseerd omdat dit gebied van de gel geen extra RNA-soorten bevatte die een nauwkeurige kwantificering van zijn fosforyleerde tegenhanger belemmerden.

Het belangrijkste om te onthouden bij een poging dit protocol is om de putten van de gel te spoelen om zelfs het laden van uw monster te garanderen. Volgens deze procedure kon een RNA-omzetexperiment worden uitgevoerd. Om de snelheid van RNA-afbraak te meten, signaleert fosforylatie vaak initiatie van RNA-afbraak.

Deze techniek maakt de weg vrij voor het beantwoorden van gedetailleerde vragen over de activiteiten specificiteit en kinetiek van polynucleotide kinases.