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Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

Este método puede responder preguntas clave sobre la fosforilación del extremo cinco-prime de las moléculas de ADN o ARN por una clase especial de enzimas conocidas como polinucleótidos quinasa. La principal ventaja de esta técnica es que tiene la resolución para detectar cambios muy pequeños en los sustratos de ADN y ARN. Comience preparando las reacciones de la enzima ARN quinasa.

Para cada reacción, combine un microlitro de sustrato de ARN nanomolar 500. 8,3 microlitros de 130 nanomolares últimos, GRC tres y 0,2 microlitros de cinco EDTA mililarios. Ajuste el bloque de calor a 37 grados centígrados.

A continuación, mezcle 0,5 microlitros de un sub stock de ATP de la serie de concentración con una mezcla de enzimas ARN y coloque la reacción en el bloque de calor. Continúe mezclando las reacciones y colocándolas en el bloque de calor a intervalos de diez segundos. Después de una incubación de 60 minutos en el bloque de calor, apagar cada reacción espiándola con 10 microlitros de tinte de carga de urea.

Realice inmediatamente análisis posteriores o almacene las reacciones en 20 grados Celsius negativos para ser analizadas en una fecha posterior. Para preparar una solución de gel de acrilamida desnaturalizadora al 15%, combine 22,5 mililitros de 40%29 premezclados a una solución de acrilamida/bis acrilamida. Seis mililitros de diez x TBE.

28,8 gramos de urea. Y RNase agua libre a un volumen total de 59 mililitros. A continuación, revuelva suavemente la solución.

Caliente la solución en el microondas durante 20 segundos. Revuelva e inmediatamente vuelva al microondas durante otros 20 segundos. Revuelva suavemente la solución hasta que la urea se disuelva por completo.

Coloque el vaso de precipitados de vidrio en un baño de aguas poco profundas, que contiene agua fría durante cinco minutos, asegurándose de que el nivel de agua fría que rodea el vaso de precipitados de vidrio está por encima del nivel de solución dentro del vaso de precipitados de vidrio. Cuando la solución esté fría, filtre y des gasee con una unidad de filtración desechable de 0,2 micrómetros para eliminar partículas y burbujas de aire microscópicas. Lave una placa de vidrio corta y larga con agua y jabón y luego rocíe cada plato con 95% de etanol y limpie el vaso para eliminar cualquier humedad.

Eleve la placa larga de la parte superior del banco colocándola encima de una caja. A continuación, coloque espaciadores de 0,4 milímetros a lo largo de los bordes largos de la placa. Poner la placa corta en la parte superior de la placa larga, asegurándose de que los bordes de la placa corta, placa larga y espaciadores están alineados.

A continuación, sujete cada lado con tres abrazaderas metálicas espaciados uniformemente. Añadir 24 microlitros de TEMED a la solución de acrilamida y mezclarlo. A continuación, añadir 600 microlitros de 10%APS e inmediatamente verter la solución entre las placas de vidrio.

Verter la solución de acrilamida entre el sándwich de placa de vidrio puede ser realmente difícil. Para evitar burbujas de aire, toque el sándwich de placa de vidrio mientras está vertiendo su solución. Agregue cuidadosamente un peine limpio de 32 pozos a la parte superior del sándwich de placa de vidrio.

Y deje que la acrilamida se polimerice durante 30 minutos. Para ejecutar el gel, ajuste el bloque de calor a 75 grados Centígrados. Retire las abrazaderas metálicas.

Y lave y seque bien el sándwich de placa de vidrio. Coloque el sándwich de placa y el aparato de gel con la placa corta mirando hacia adelante y prepare 0,5 X TBE tampón de funcionamiento mediante la combinación de 100 mililitros de 10 X TBE con 1,9 litros de agua libre RNase. Agregue 600 mililitros del tampón de funcionamiento a las cámaras superior e inferior del aparato.

Retire suavemente el peine del gel y enjuague bien los pozos con una jeringa. Pre-ejecutar el gel a 50 vatios durante 30 minutos. A continuación, enjuague los pozos de nuevo.

Post spin las reacciones de enfriamiento y incubarlas a 75 grados Celsius durante tres minutos. Repita el giro del pulso y cargue inmediatamente 10 microlitros de cada muestra en el gel. A continuación, ejecute el gel durante tres horas a 50 vatios.

Cuando la carrera haya terminado, apague la fuente de alimentación y drene la cámara superior del aparato. Lave y seque el lado exterior del sándwich de placa de vidrio. A continuación, cúbralo con papel de aluminio y transfiételo a un escáner láser para obtener imágenes.

Monte el sándwich de placa de vidrio en el escenario del escáner láser. Ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión para el suelo deseado para e imagen del gel. Aquí se muestra un gel de desnaturalismo exitoso representativo de una valoración de ATP con una cantidad fija de último complejo GRC tres.

La adición de enzima dio lugar a una última escisión de ARN mediada de la Saccharomyces cerevisiae ITS dos sustrato de ARN, dando lugar a un fragmento de ARN definido. Tras la adición de ATP, el fragmento de ARN C2 fue fosforilado por GrC3 PNK. Para visualizar la fosforilación del fragmento de ARN C2, la cantidad relativa de ARN C2 sin fosforilado y fosforilado se antipentó contra la concentración de ATP.

Nuestro gel de desnaturalismo sin éxito se muestra aquí. El sustrato de ARN de 21 nucleótidos contenía productos de degradación, que se superponía con el producto fosforilado e imposibilitó cuantificar con precisión la fosforilación. Por el contrario, el producto de degradación de ARN más corto podría ser analizado con éxito porque esta área del gel no contenía ninguna especie de ARN adicional que obstaculizara la cuantificación precisa de su contraparte fosforilada.

Lo más importante a recordar al intentar este protocolo es enjuagar los pozos del gel para asegurar la carga uniforme de la muestra. Después de este procedimiento, se podría realizar un experimento de rotación de ARN. Para medir las tasas de degradación del ARN, la fosforilación a menudo indica el inicio de la degradación del ARN.

Esta técnica allana el camino para responder preguntas detalladas sobre la especificidad de las actividades y la cinética de las quinasas de polinucleótidos.