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이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.
이 방법은 폴리뉴클레오티드 키나아제로 알려진 효소의 특별한 클래스에 의해 DNA 또는 RNA 분자의 5-프라임 엔드의 인산화에 대한 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 와 RNA 기판에 있는 아주 작은 변경을 검출하는 해상도가 있다는 것입니다. RNA 효소 키나아제 반응을 준비하여 시작합니다.
각 반응에 대해, 500 나노 몰라 RNA 기판의 하나의 마이크로 리터를 결합. 8.3 마이크로리터 130 나노몰라 마지막 하나, GRC 3 및 0.2 5 밀리머 EDTA의 마이크로 리터. 열 블록을 섭씨 37도로 설정합니다.
그런 다음 농도 계열에서 ATP 서브 스톡의 0.5 마이크로리터를 하나의 RNA 효소 혼합물과 혼합하고 열 블록에 반응을 배치합니다. 반응을 계속 혼합하고 열 블록에 10 초 간격으로 배치합니다. 히트 블록에 60 분 인큐베이션 후, 우레아 로딩 염료의 10 마이크로 리터로 스파이크하여 각 반응을 담금질.
즉시 다운스트림 분석을 수행하거나 나중에 분석할 수 있는 음수 섭씨 20도에 반응을 저장합니다. 15%의 데니어링 아크릴아미드 젤 용액을 준비하려면 22.5밀리리터의 사전 혼합 40%29~1개의 아크릴아미드/비스 아크릴아미드 용액을 결합합니다. 10 x TBE의 6 밀리리터.
28.8 그램의 우레아. 그리고 RNase는 총 59 밀리리터에 물을 무료. 그런 다음 용액을 부드럽게 저어줍니다.
전자레인지에서 20초 동안 용액을 가열합니다. 저어서 즉시 전자레인지에 20초 간 반납합니다. 우레아가 완전히 녹을 때까지 용액을 부드럽게 저어줍니다.
유리 비커를 5분 동안 차가운 물이 들어 있는 얕은 수조에 넣고 유리 비커를 둘러싼 차가운 물의 수준이 유리 비커 내부의 용액 수준 보다 높은지 확인합니다. 용액이 시원할 때, 0.2 마이크로미터 일회용 여과 장치로 필터를 제거하고 미립자 및 미세한 기포를 제거합니다. 비누와 물로 짧고 긴 유리 접시를 씻은 다음 각 접시에 95 %에탄올로 스프레이하고 유리를 닦아 수분을 제거하십시오.
상자 위에 놓아 벤치 상단에서 긴 플레이트를 높이게 합니다. 그런 다음 플레이트의 긴 가장자리를 따라 0.4 밀리미터 스페이서를 배치합니다. 긴 접시 위에 짧은 접시를 놓고 짧은 플레이트, 긴 플레이트 및 스페이서의 가장자리가 정렬되었는지 확인합니다.
그런 다음 세 개의 균일하게 간격이 있는 금속 클램프로 각 면을 고정합니다. 아크릴아미드 용액에 24마이크로리터의 TEMED를 넣고 섞습니다. 그런 다음 10%APS의 600 마이크로리터를 추가하고 즉시 유리 플레이트 사이에 용액을 붓습니다.
유리 접시 샌드위치 사이에 아크릴아미드 용액을 붓는 것은 정말 어려울 수 있습니다. 기포를 피하기 위해 솔루션을 붓는 동안 유리 접시 샌드위치를 누릅니다. 유리 접시 샌드위치 의 상단에 깨끗한 32 웰 빗을 조심스럽게 추가합니다.
그리고 아크릴아미드가 30분 동안 중합되도록 한다. 젤을 실행하려면 열 블록을 섭씨 75도로 설정합니다. 금속 클램프를 제거합니다.
그리고 철저하게 세척하고 유리 접시 샌드위치를 건조. 플레이트 샌드위치와 젤 장치를 짧은 플레이트와 함께 앞뒤로 배치하고 10 X TBE의 100 밀리리터를 1.9 리터의 RNase 프리 워터와 결합하여 0.5 X TBE 실행 버퍼를 준비합니다. 장치의 상부 및 하부 챔버에 실행 버퍼의 600 밀리리터를 추가합니다.
젤에서 빗을 부드럽게 제거하고 주사기로 우물을 완전히 헹신다. 젤을 50 와트로 30분 동안 미리 실행합니다. 그런 다음 우물을 다시 헹양시십시오.
포스트는 담금질 반응을 회전하고 3 분 동안 섭씨 75도에서 배양. 펄스 스핀을 반복하고 각 샘플의 10 마이크로리터를 젤에 즉시 로드합니다. 그런 다음 50 와트에서 3 시간 동안 젤을 실행합니다.
실행이 완료되면 전원 공급 장치를 끄고 장치의 상부 챔버를 배출하십시오. 유리 접시 샌드위치의 바깥쪽을 씻고 건조시다. 그런 다음 호일로 덮고 레이저 스캐너로 전달하여 이미징을 합니다.
레이저 스캐너의 무대에 유리 플레이트 샌드위치를 마운트합니다. 원하는 바닥에 대한 여기 및 방출 파장을 설정하고 젤을 이미지화합니다. 여기에 표시된 것은 마지막 하나의 GRC 3 복합체의 고정된 양을 가진 ATP의 적정의 대표적인 성공적인 데스팅 젤이다.
효소의 첨가는 Saccharomyces cerevisiae ITS 2 RNA 기판의 마지막 1개의 중재된 RNA 분열 귀착되고, 정의된 RNA 단편으로 이끌어 냈다. ATP의 첨가 시, C2 RNA 단편은 GrC3 PNK에 의해 인포화되었다. C2 RNA 단편의 인산화를 시각화하기 위해, 인포싱및 인포증 C2 RNA의 상대적 양은 ATP 농도에 대하여 플롯되었다.
우리의 대표적인 실패한 데마링 젤이 여기에 표시됩니다. 21개의 뉴클레오티드 RNA 기판에는 인산화 된 제품과 겹쳐서 인산화를 정확하게 정량화하는 것이 불가능하게 만든 분해 생성물이 포함되어 있습니다. 대조적으로, 가장 짧은 RNA 분해 생성물은 겔의 이 지역이 인산화된 대응물의 정확한 정량화를 방해하는 추가 RNA 종을 포함하지 않았기 때문에 성공적으로 분석될 수 있었다.
이 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 샘플의 로딩을 보장하기 위해 젤의 우물을 헹두는 것입니다. 이 절차에 따라 RNA 회전율 실험을 수행할 수 있습니다. RNA 분해의 비율을 측정하기 위하여는, 인산화는 수시로 RNA 분해의 개시를 신호합니다.
이 기술은 폴리뉴클레오티드 키나아제의 활동 특이성 및 운동성에 대한 상세한 질문에 대답할 수 있는 길을 열어줍니다.
