Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater

Denne metode kan besvare centrale spørgsmål om fosforylering af de fem-prime ende af DNA eller RNA molekyler ved en særlig klasse af enzymer kendt som polynukleotid kinase. Den største fordel ved denne teknik er, at den har opløsningen til at detektere meget små ændringer i DNA- og RNA-substrater. Begynd med at forberede RNA-enzymets kinasereaktioner.

For hver reaktion skal du kombinere en mikroliter på 500 nanomolar RNA-substrat. 8,3 mikroliter af 130 nanomolar sidste, GRC tre og 0,2 mikroliter af fem millimolar EDTA. Indstil varmeblokken til 37 grader Celsius.

Bland derefter 0,5 mikroliter af en ATP-understrøm fra koncentrationsserien med en RNA-enzymblanding, og anfør reaktionen på varmeblokken. Fortsæt med at blande reaktionerne og placere dem på varmeblokken med ti sekunders mellemrum. Efter en 60 minutters inkubation på varmeblokken skal hver reaktion slukkes ved at spytte den med 10 mikroliter urinstofbelastningsfarvestof.

Straks udføre downstream analyse eller gemme reaktionerne ved negative 20 grader Celsius, der skal analyseres på et senere tidspunkt. For at forberede en 15% denaturering acrylamid gel opløsning, kombinere 22,5 milliliter af præ-blandet 40%29 til en acrylamid / bis acrylamid opløsning. Seks milliliter af ti x TBE.

28,8 gram urinstof. Og RNase frit vand til et samlet volumen på 59 milliliter. Rør derefter forsigtigt opløsningen.

Opløsningen opvarmes i mikrobølgeovnen i 20 sekunder. Rør den om og vend den straks tilbage til mikrobølgeovnen i yderligere 20 sekunder. Rør forsigtigt opløsningen, indtil urinstofet er helt opløst.

Anlænde glasbægeren i et lavt vandbad, der indeholder koldt vand i fem minutter, og sørg for, at niveauet af koldt vand omkring glasbægeren er over opløsningsniveauet inde i glasbægeret. Når opløsningen er afkølet, filtreres og afgasser den med en 0,2 to mikrometer engangsfiltreringsenhed for at fjerne partikler og mikroskopiske luftbobler. Vask en kort og lang glasplade med sæbe og vand derefter spray hver plade med 95% ethanol og tør glasset for at fjerne fugt.

Løft den lange plade af bordpladen ved at placere den oven på en kasse. Placer derefter 0,4 millimeter afstandsedler langs pladens lange kanter. Læg den korte plade oven på den lange plade, og sørg for, at kanterne af den korte plade, lange plade og afstandsfraen er justeret.

Derefter klemme hver side med tre jævnt fordelt metal klemmer. Tilføj 24 mikroliter TEMED til acrylamidopløsningen, og bland den. Derefter tilsættes 600 mikroliter på 10% APS og hæld straks opløsningen mellem glaspladerne.

Hælde acrylamid løsning mellem glasplade sandwich kan være virkelig udfordrende. For at undgå luftbobler skal du trykke på glaspladesandwichen, mens du hælder din opløsning. Tilsæt forsigtigt en ren kam på 32 brønde til toppen af glaspladesandwichen.

Og lad acrylamid at polymerisere i 30 minutter. For at køre gelen skal du indstille varmeblokken til 75 grader Celsius. Fjern metalklemmerne.

Og vask og tør glaspladesandwich grundigt. Anvend pladesandwichen og gelapparatet med den korte plade vendt fremad og klargør 0,5 X TBE løbebuffer ved at kombinere 100 milliliter 10 X TBE med 1,9 liter RNase frit vand. Der tilsættes 600 milliliter løbebufferen til apparatets øvre og nedre kamre.

Fjern forsigtigt kammen fra gelen og skyl brøndene grundigt med en sprøjte. For-kør gelen på 50 Watt i 30 minutter. Skyl derefter brøndene igen.

Post spin dæmpningen reaktioner og inkubere dem ved 75 grader Celsius i tre minutter. Gentag pulsspinen, og indlæs straks 10 mikroliter af hver prøve på gelen. Kør derefter gelen i tre timer ved 50 Watt.

Når løbet er færdigt, skal du slukke for strømforsyningen og tømme apparatets øverste kammer. Vask og tør den ydre side af glaspladen sandwich. Derefter dække det med folie og overføre det til en laserscanner til billedbehandling.

Monter glaspladesandwichen på laserscannerens scene. Indstil excitation og emission bølgelængder for det ønskede gulv for og billede gelen. Vist her er en repræsentativ vellykket denaturering gel af en titrering af ATP med et fast beløb på sidste grc tre kompleks.

Tilsætning af enzym resulterede i sidste medieret RNA-spaltning af Saccharomyces cerevisiae ITS to RNA-substrat, hvilket førte til et defineret RNA-fragment. Ved tilsætning af ATP blev C2 RNA-fragmentet fosforyleret af GrC3 PNK. For at visualisere fosforyleringen af C2 RNA-fragmentet blev den relative mængde uphosphorylated og fosforyleret C2 RNA afbildet mod ATP-koncentrationen.

Vores repræsentant mislykket denaturering gel er vist her. Det 21 nukleotid RNA-substrat indeholdt nedbrydningsprodukter, som overlappede med det fosforylerede produkt og gjorde det umuligt præcist at kvantificere fosforylation. I modsætning hertil kunne det korteste RNA nedbrydningsprodukt analyseres med succes, fordi dette område af gelen ikke indeholdt yderligere RNA-arter, der hindrede nøjagtig kvantificering af dets fosforylerede modstykke.

Vigtigst ting at huske, når du forsøger denne protokol er at skylle brønde af gelen for at sikre selv belastning af din prøve. Efter denne procedure kunne der udføres et RNA-omsætningseksperiment. For at måle satserne for RNA-nedbrydning signalerer fosforylering ofte initiering af RNA-nedbrydning.

Denne teknik baner vejen for besvarelse af detaljerede spørgsmål om aktiviteterne specificitet og kinetik af polynukleotid kinaser.