छोटे न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के पॉलीन्यूक्लियोटाइड फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए गैर-रेड्रियक परख

यह विधि पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ के रूप में जाने जाने वाले एंजाइमों के एक विशेष वर्ग द्वारा डीएनए या आरएनए अणुओं के पांच-प्राइम एंड के फॉस्फोरिलेशन के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब दे सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि डीएनए और आरएनए सब्सट्रेट्स में बहुत छोटे बदलावों का पता लगाने का संकल्प है। आरएनए एंजाइम किनेज़ प्रतिक्रियाओं को तैयार करके शुरू करें।

प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 500 नैनोमोलर आरएनए सब्सट्रेट के एक माइक्रोलीटर को मिलाएं। 130 नैनोमोलर के 8.3 माइक्रोलीटर पिछले एक, जीआरसी तीन और पांच मिलीमोलर ईडीटीए के 0.2 माइक्रोलीटर। हीट ब्लॉक को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।

फिर एक आरएनए एंजाइम मिश्रण के साथ एकाग्रता श्रृंखला से एक एटीपी सब स्टॉक के 0.5 माइक्रोलीटर मिश्रण और गर्मी ब्लॉक पर प्रतिक्रिया जगह है। प्रतिक्रियाओं को मिलाने और उन्हें दस सेकंड अंतराल पर हीट ब्लॉक पर रखना जारी रखें। हीट ब्लॉक पर 60 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, यूरिया लोडिंग डाई के 10 माइक्रोलीटर के साथ स्पाइकिंग करके प्रत्येक प्रतिक्रिया को बुझाएं।

तुरंत डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करें या प्रतिक्रियाओं को बाद की तारीख में विश्लेषण करने के लिए नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 15% एक्रिलैमाइड जेल समाधान तैयार करने के लिए, 22.5 मिलीलीटर पूर्व-मिश्रित 40% 29 को एक एक्रिलामाइड/बीआईएस एक्रिलैमाइड समाधान में मिलाएं। दस एक्स TBE के छह मिलीलीटर ।

28.8 ग्राम यूरिया। और RNase ५९ मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए मुफ्त पानी । फिर धीरे-धीरे समाधान हिलाएं।

घोल को माइक्रोवेव में 20 सेकंड के लिए गर्म करें। इसे हिलाओ और तुरंत इसे एक और 20 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में वापस । धीरे-धीरे घोल को तब तक हिलाएं जब तक यूरिया पूरी तरह से घुल न जाए।

कांच बीकर को उथले पानी के स्नान में रखें, जिसमें पांच मिनट के लिए ठंडे पानी होते हैं, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि ग्लास बीकर के आसपास के ठंडे पानी का स्तर ग्लास बीकर के अंदर समाधान के स्तर से ऊपर है। जब समाधान ठंडा होता है, तो कणों और सूक्ष्म हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 0.2 दो माइक्रोमीटर डिस्पोजेबल निस्पंदन इकाई के साथ इसे फ़िल्टर और डी-गैस करें। साबुन और पानी के साथ एक छोटी और लंबी ग्लास प्लेट धोएं फिर प्रत्येक प्लेट को 95% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और किसी भी नमी को हटाने के लिए ग्लास को पोंछ दें।

एक बॉक्स के ऊपर रखकर बेंच टॉप से लंबी प्लेट को ऊंचा करें। फिर प्लेट के लंबे किनारों के साथ 0.4 मिलीमीटर स्पेसर की स्थिति रखें। लंबी प्लेट के शीर्ष पर छोटी प्लेट बिछाएं, जिससे यह सुनिश्चित हो जाए कि छोटी प्लेट, लंबी प्लेट और स्पेसर्स के किनारों को गठबंधन किया जाए।

फिर तीन समान रूप से दूरी धातु क्लैंप के साथ प्रत्येक पक्ष को क्लैंप करें। एक्रिलैमाइड सॉल्यूशन में टेमीड के 24 माइक्रोलीटर डालकर मिला लें। फिर 10% एपीएस के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और तुरंत ग्लास प्लेटों के बीच समाधान डालें।

ग्लास प्लेट सैंडविच के बीच एक्रिलैमाइड समाधान डालना वास्तव में चुनौतीपूर्ण हो सकता है। हवा के बुलबुले से बचने के लिए, जब आप अपना समाधान डाल रहे हों तो ग्लास प्लेट सैंडविच को टैप करें। ध्यान से ग्लास प्लेट सैंडविच के शीर्ष पर एक साफ 32-अच्छी तरह से कंघी जोड़ें।

और एक्रिलैमाइड को 30 मिनट के लिए बहुलक होने दें। जेल चलाने के लिए, हीट ब्लॉक को 75 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। धातु क्लैंप निकालें।

और ग्लास प्लेट सैंडविच को अच्छी तरह धोकर सुखा लें। प्लेट सैंडविच और जेल उपकरण को आगे की ओर सामना करने वाली छोटी प्लेट के साथ रखें और 10 एक्स टीबीई के 100 मिलीलीटर को 1.9 लीटर आरएनएसई मुक्त पानी के साथ जोड़कर 0.5 X TBE रनिंग बफर तैयार करें। उपकरण के ऊपरी और निचले कक्षों में चल रहे बफर के 600 मिलीलीटर जोड़ें।

धीरे-धीरे जेल से कंघी निकालें और कुओं को सिरिंज से अच्छी तरह से कुल्ला करें। 30 मिनट के लिए 50 वाट पर जेल को प्री-चलाएं। इसके बाद फिर से कुएं को खंगाल डाला।

शमन प्रतिक्रियाओं को स्पिन करने के बाद उन्हें तीन मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पल्स स्पिन को दोहराएं और तुरंत जेल पर प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोलीटर लोड करें। इसके बाद 50 वाट पर तीन घंटे तक जेल चलाएं।

जब रन समाप्त हो गया है, बिजली की आपूर्ति बंद करो और उपकरण के ऊपरी कक्ष नाली । कांच की प्लेट सैंडविच के बाहरी हिस्से को धोकर सुखा लें। फिर इसे पन्नी से ढक कर इमेजिंग के लिए लेजर स्कैनर में ट्रांसफर कर दें।

लेजर स्कैनर के मंच पर ग्लास प्लेट सैंडविच माउंट। जेल के लिए वांछित मंजिल के लिए उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें और छवि करें। यहां दिखाया गया है कि पिछले एक जीआरसी तीन परिसर की एक निश्चित राशि के साथ एटीपी के एक टिटरेशन का एक प्रतिनिधि सफल डेनैचिंग जेल है।

एंजाइम के अलावा पिछले एक मध्यस्थता आरएनए दरार के परिणामस्वरूप सैकरोमाइसिस सेरेविसीए इट्स दो आरएनए सब्सट्रेट, जिससे एक परिभाषित आरएनए टुकड़ा हो गया। एटीपी के अलावा, C2 आरएनए टुकड़ा GrC3 PNK द्वारा फॉस्फोरिलेटेड था । C2 आरएनए टुकड़े के फॉस्फोरिलेशन की कल्पना करने के लिए, एटीपी एकाग्रता के खिलाफ अनफोस्फोरिलेटेड और फॉस्फोरिलेटेड सी 2 आरएनए की सापेक्ष मात्रा की साजिश रची गई थी।

हमारे प्रतिनिधि असफल डेनैचिंग जेल यहां दिखाया गया है । 21 न्यूक्लियोटाइड आरएनए सब्सट्रेट में गिरावट वाले उत्पाद शामिल थे, जो फॉस्फोरिलेटेड उत्पाद के साथ छा गए और फॉस्फोरिलेशन को सटीक रूप से बताना असंभव बना दिया। इसके विपरीत, सबसे कम आरएनए क्षरण उत्पाद का सफलतापूर्वक विश्लेषण किया जा सकता है क्योंकि जेल के इस क्षेत्र में कोई अतिरिक्त आरएनए प्रजातियां शामिल नहीं थीं जो इसके फॉस्फोरिलेटेड समकक्ष के सटीक मात्राकरण में रुकावट डालती थीं।

इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि आपके नमूने को लोड करने के लिए जेल के कुओं को कुल्ला करना है। इस प्रक्रिया के बाद, एक आरएनए कारोबार प्रयोग किया जा सकता है । आरएनए क्षरण की दरों को मापने के लिए, फॉस्फोरिलेशन अक्सर आरएनए क्षरण की शुरुआत का संकेत देती है।

यह तकनीक पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेस की गतिविधियों विशिष्टता और काइनेटिक्स के बारे में विस्तृत सवालों का जवाब देने का मार्ग प्रशस्त करती है।