Cancer Research
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自动差分核染色测定，准确测定三元细胞毒性
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Summary May 12th, 2020
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该协议描述了一种快速、高通量、可靠、廉价和公正的检测方法，用于有效确定细胞的可行性。当细胞的线粒体受损时，这种测定特别有用，这干扰了其他检测。该测定使用自动计数细胞染色的两种核染料 - Hoechst 33342 和碘化丙二钠。
Transcript
这种方法将允许研究人员评估细胞生存能力独立于线粒体功能。并且它支持高通量药物筛查工作。该技术快速、准确、廉价，可测定化合物细胞毒性，包括大多数细胞类型的线粒体功能。
该协议易于执行。重视药物制备、治疗条件和细胞密度，确保实验的准确性和有效性。此方法的可视化演示非常重要，因为图像采集和图像分析步骤可能难以概括，尤其是对于对 Gen5 软件经验很少的研究人员。
首先，在所需浓度下制备感兴趣的化合物溶液。始终确保通过彻底涡旋混合化合物。要测量单个化合物的细胞毒性，以2倍的最终浓度准备化合物。
如果测量化合物组合的细胞毒性，以4倍的最终浓度进行准备。仅通过将相同数量的溶剂与适当的介质混合来准备溶剂控制。将细胞收集到15毫升圆锥管和10微升细胞悬浮液中。
对于 trypan 蓝色染色，在等分中加入 10 微升 0.4% trypan 蓝色，并使用血细胞计或细胞计数器来计数可行和非活细胞。在15毫升管中，以200次G为单位的颗粒细胞5分钟，然后吸气或去吸上分。我们暂停细胞颗粒在散文适当的介质在细胞密度的三倍10至第五细胞每毫升。
使用多通道移液器将50微升的电池悬浮液播种到96井板的每个井中。对于单化合物测定，将50微升2X化合物溶液加入到每一井中。对于溶剂控制井，加入15微升含有溶剂的测试介质，浓度为2倍。
对于组合测定，将每个4X化合物的25微升添加到每个井中。对于单化合物控制井，每 4X 复合溶液和测试介质添加 25 微升。确保 DMSO 的最终浓度不超过 0.5%为确保可重复性，请添加带移液器尖端接触井侧的药物。
小心把药物加到不同的地方。这种刺应该执行非常快，最好需要不超过30分钟每板。轻轻敲击板，混合井内装物，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育。
当准备用 Hoechst 33342 和碘化丙二的二氧化二烯染色细胞染色时，准备新鲜的 10X 染色溶液，并在每个井中加入 10 微升。轻轻敲拍盘子，在37摄氏度下孵育15分钟。将板在 200 倍 G 下离心 4 分钟，将所有电池带到板的底部。
然后用潮湿的实验室擦拭小心地擦拭板的底部，以清除任何可能干扰成像的碎屑。离心后 15 分钟内对板进行成像。打开 Gen5 软件并创建新的标准协议，单击程序并选择要使用的板类型。
通常，96个黑色塑料板。接下来，将读取方法设置为图像，单击"确定"，然后选择具有 4 倍放大目标的 DAPI 和德州红色滤镜集。无需偏移，因为井中心将被成像。
对于 DAPI 滤波器，将 LED 设置为 10，将集成时间设置为 99，增益为零。对于德州红，将 LED 设置为 8，集成时间设置为 950，增益为 18。单击"选项"，确保自动对焦在 DAPI 通道上执行，并且通道之间的对焦没有偏移。
单击"确定"保存协议。现在可以使用"读取新"按钮录制图像。记录图像后，单击"减少数据"并选择图像预处理。
使用基于 DAPI 信号的自动拼合大小应用具有深色背景减法的图像预处理。对于德州红，使用与通道 1 相同的选项。完成后，单击"确定"。
然后转到蜂窝分析面板，根据转换的 DAPI 信号应用核掩码，阈值为 6，000 个单位，最小对象大小为 5 微米，最大对象大小为 25 微米。分析整个图像，排除图像边框上的主要边缘对象和拆分接触对象。在高级检测选项中，将滚球直径设置为 30 微米，并基于最低像素的 5% 评估背景。
仅将单元格计数保留为计算指标。之后，根据平均变换的德州红信号执行亚填充分析，阈值为 5，000 个单位，以计算死细胞。最后，访问生成的单元格计数。
此处显示了沾有 Hoechst、碘化钠的细胞的代表性图像。细胞总数相当高，并且大于死细胞的数量。当一组细胞毒性测定与尝试蓝排除进行比较时，发现MTT和阿拉玛蓝测定结果对细胞的生存能力测量不准确。
这些线粒体酶为基础的测定显示，与尝试蓝色排除相比，其可行性显著降低。使用 Hoechst 33342 和 PI 的双染色具有鲁棒性、灵敏度和与 trypan 蓝色染色的最佳结合，以及 CCP 或 2-DG 处理后与 trypan 蓝色排除方法的最小中位数偏差。Hoechst PI 文章还有效地确定细胞在治疗后与线粒体目标分子 Rotenone 和三溴基鲁酮的细胞生存能力。
它得到了进一步验证与白血病细胞系面板。这些细胞在Rotenone敏感性中变化不一，从非常敏感到抗性细胞。检测性能不当可能会损害其准确性。
此处显示了几个受损的结果。过度污染 PI、忽略离心步骤或在 Hoechst 通道中过度曝光将导致效果欠佳。定时此协议时，请记住优化每个细胞系的染料浓度和染色时间。
此外，为确保成像质量，样品板的分分化是必要的。在确定细胞毒性对癌细胞有作用的化合物后，研究人员可以进行机械研究，以确定其相关目标。与传统的MTT测定技术并行筛选小分子库，将允许对线粒体功能的分子快速识别。
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