Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Stabilitet og struktur Bat Major Histocompatibility Complex Klasse I med heterolog β₂-Microglobulin

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Journal (Immunology and Infection)

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking

Journal (Immunology and Infection)

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking

Click here for the English version

Stabilitet og struktur Bat Major Histocompatibility Complex Klasse I med heterolog β₂-Microglobulin

Article DOI: 10.3791/61462-v

March 10th, 2021 •

Di Zhang*^1,2, Kefang Liu*^3,4, Dan Lu*^2,5, Pengyan Wang^1,2, Qingxu Zhang^1,2, Peipei Liu², Yingze Zhao², Yan Chai⁴, Jianxin Lyu¹, Jianxun Qi⁴, William J. Liu^1,2

¹School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, ²NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau, ⁴CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, ⁵Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 10th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Protokollen beskriver eksperimentelle metoder til at opnå stabile større histokompatibilitetskomplekser (MHC) klasse I gennem_potentielleβ 2-mikroglobulin (β₂m) substitutioner fra forskellige arter. Den strukturelle sammenligning af MHC I stabiliseret af homologe og heterologe β₂m blev undersøgt.

Transcript

I denne undersøgelse brugte vi Bat MHC klasse I som model til at opsummere metoden og til at evaluere gennemførligheden af en hybrid MHC-klasse I, der er kompleks med heterolog beta-2 mikroglobulin. Tidligere undersøgelser har vist, at pattedyr B2M substitution ikke i væsentlig grad påvirker peptid præsentation. Faktisk kan hybrid MHC klasse I aktivere en lignende struktur og funktion til det oprindelige molekyle.

Disse teknikker kan bruges til at lette den funktionelle og strukturerede undersøgelse af MHC I for vævsrespons evaluering under smitsomme sygdomme og tumor immunterapi. For E.coli kultur transformation tilføje 10 nanogram plasmid indeholder flagermus eller human MHC klasse I beta to mikroglobulin brint kæde til 100 mikroliter af udlignet suspension og bade suspensionen i is i 30 minutter. Ved afslutningen af inkubationen choker bakterierne i 90 sekunder ved 42 grader Celsius og returnerer kulturen til isbadet i to minutter.

Derefter tilsættes 800 mikroliter lysogeny bouillon til kulturen, og ryst suspensionen på en gyngeplatform i 20 minutter ved 37 grader Celsius og 200 rotationer i minuttet. Ved afslutningen af inkubationen spredes 100 mikroliter af bakterierne på et passende antibiotikaresistent kulturblad. Den næste morgen skal du vælge en enkelt nyligt omdannet bakterieklon og vaccinere klonen med tre milliliter LB med antibiotisk medium.

Placer kulturen på gyngeplatformen ved 37 grader Celsius i 12 til 16 timer. Næste morgen overføres 500 mikroliter af den aktiverede bakteriebestand til 50 milliliter LB med antibiotisk medium, og bakterierne returneres til den vuggende inkubator natten over. Opdel den resterende aktiverede bakteriebestand i 500 mikroliter aliquots og tilsæt hver aliquot til 500 mikroliter mængder på 40% glycerol, for minus 80 grader Celsius opbevaring.

For at generere store mængder rekombinant protein overføres bakterieophænget næste morgen til to liter LB med antibiotisk medium ved et forhold på 1 til 100 og returnerer kulturen til den vuggende inkubator, indtil der opnås en absorbans på 0,6 ved 600 nanometer. Derefter tilsættes en millimolar IPTG til kulturen for at fremkalde ekspression af transgenet. Efter fire til seks timers induktion overføres bakteriekulturen til flasker til centrifugering, og bakteriecellepillerne suspenderes igen i 60 milliliter PBS pr. flaske.

Frigør derefter det udtrykte rekombinante protein ved ultralydscelleforstyring 99 gange i seks sekunder og et interval på 12 sekunder ved 300 Watt pr. Sonication. Til optagelse af kropsrensning opsamles de sonikerede bakterier ved centrifugering, og pellets suspenderes igen i en passende mængde vaskebuffer til yderligere to centrifugeringer. Efter den anden vask, suspendere optagelse organer og re-suspension buffer, og der er afsat en 20 microliter aliquot af prøven for SDS side for at teste optagelse kroppen renhed.

Centrifuge den resterende prøve og veje det indeslutningsorgan, der indeholder pellet. Der tilsættes opløsningsbuffer til pellets til en endelig koncentration på 30 milligram inklusionskrop pr. milliliter buffer. Og brug en magnetisk omrører til langsomt at røre opløsningen ved fire grader Celsius, indtil inklusionsorganerne opløses i opløsningsbufferen.

Efter at have kasseret bundfaldet skal du opbevare inklusionsorganerne ved minus 20 eller minus 80 grader Celsius. For MHC kompleks refolding, tilføje en fem millimolar reduceret glutathion og 0,5 millimolar oxideret glutathion ved 250 til 300 milliliter, en fire grader Celsius refolding buffer. Og rør langsomt opløsningen på en magnetisk omrører ved fire grader Celsius i 10 til 20 minutter.

For MHC hydrogenkæde og beta to mikroglobulin fortynding, indlæse optagelse kroppen i en en milliliter sprøjte og injicere hele en milliliter volumen optagelse kropsopløsning i en liter refolding buffer nær rørestangen, for at opnå en hurtig og effektiv fortynding. Derefter opløses fem milligram pr. milliliter peptid i dimethylsulfoxid, og der injiceres hurtigt 200 mikroliter peptid i refoldingsopløsningen, som det netop er påvist. Efter 10 til 20 minutters langsom omrøring injiceres tre milliliter H-kædeinddragelsesorganer i et nyt volumen på en liter refoldingsbuffer og lad refolding fortsætte ved fire grader Celsius i otte til 10 timer.

For at bestemme den refolded proteinkoncentration tilsættes udvekslingsbuffer til et trykkammer med en 10 kilodalton multi kobberoxidasemembran og koncentrerer bufferen til 30 til 50 milliliter volumen. Refoldingsopløsningen overføres til et centrifugerør, og bundfaldet fjernes ved centrifugering. Overfør forsigtigt supernaten ind i kammeret, og koncentrer bufferen yderligere til et slutvolumen på ca. en milliliter.

Fjern eventuelle endelige forurenende stoffer ved centrifugering, og overfør supernatet til et sterilt rør. Brug en ti tre hundrede GL størrelse udelukkelse kolonne til at rense proteiner, indsamle prøverne på toppen, og analysere dem ved hjælp af SDS side. Opsamle MHC komplekse peak og koncentrere proteinet til en endelig koncentration på 15 milligram per milliliter.

Derefter fortyndes komplekset til 7,5 milligram pr. milliliterkoncentration. For at udføre krystallisering af den komplekse MHC og peptid ved hjælp af siddedråbediffusionsteknikken skal du tilføje 0,8 mikroliter af prøven til et kommercielt krystalbræt og forsegle brættet. Prøveopløsningen skal ligestilles med 100 mikroliter reservoiropløsning ved fire eller 18 grader Celsius og bruge et mikroskop til regelmæssigt at observere krystalvæksten i løbet af de næste seks måneder.

For kryogen beskyttelse overfører krystallerne ved forsøgets afslutning til en opbevaringsopløsning, der indeholder 20% glycerol, før prøverne hurtigt afkøles i en 100 graders Kelvin gasformig nitrogenstrøm. Derefter indsamle x-ray diffraktion data i henhold til standard protokoller. For at bestemme strukturen af krystalkomplekserne skal du åbne de strukturelle røntgendiffraktionsdata i høj opløsning i Denzo-programmet i HK L 2000-softwarepakken og vælge en indledende model i proteindatabanken.

For at bestemme proteinets struktur skal du åbne dataene i Phaser MR-programmet i CCP4 og bruge den raffinerede røntgenmodel til den første fælles raffinement. Brug derefter Phoenix forfine alene og fælles tilstande for x-ray alene raffinement, og den fælles neutron for x-ray raffinement. Efter hver runde af raffinement, manuelt kontrollere modellen mod Fo-Fc, og 2Fo-Fc positive nukleare tæthed kort i Coot.

I disse repræsentative eksperimenter blev den bindende kapacitet af Hendra Virus afledt Hendra Virus One peptid til bat MHC klasse I brint kæder med homolog bat beta to mikroglobulin og heterologe menneskelige beta to mikroglobulin blev evalueret. I begge analyser blev krystaller med høj opløsning dannet ved renaturation med beta to mikroglobulin lyskæde. I mangel af beta to mikroglobulin dannes disse komplekser ikke.

I MHC klasse I brintkæden Hendra Virus 1, human beta to mikroglobulin struktur, bevarede rester H31, D53, W60, og Y63 af human beta to mikroglobulin, som svarer til bat beta to mikroglobulin, komme i kontakt med bunden af peptid bindende groove og bevaret Q8, Y10, R12, og 24 rester, som svarer til beta to mikroglobuliner bundet til alfa tre domæne. I den samlede flagermus og menneskelige strukturer, den gennemsnitlige rod gennemsnitlige kvadratafledning af rester en til 184 af brint kæder er 0,248 under alle carbon alpha atom's superpositioner, hvilket tyder på, at der ikke er nogen forskelle mellem disse to komplekser. Strukturen af peptidjusteringen viser, at bekræftelserne af Hendra Virus en peptider i disse to komplekser er ret ens.

Sekvensjustering viser også, at aminosyrerne i beta to mikroglobulin fra forskellige arter er stærkt bevaret. Det er vigtigt at tilbyde modstanderkomplekserne med en høj rapporteringseffektivitet. Derfor er det vigtigt at vælge passende beta to mikro globulin og til at bruge meget renset inklusion organer.

Denne protokol kan bruges til at opnå stabile MTC I kompleks gennem potentielle beta to mikroglobulin substitutioner i andre arter, og at eksistere de er MTC I struktur og funktion. De data, der opnås fra disse undersøgelser kan bruges til at vurdere T-celle reaktioner under smitsomme sygdomme og tumor immunterapier.

X

Simple Hit Counter