This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Förberedelse av akuta skivor från Dorsal Hippocampus för helcellsinspelning och neuronal rekonstruktion i den dentate gyrus av vuxna möss
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar ett protokoll för att förbereda akuta skivor från dorsala-mellanliggande hippocampus av möss. Vi jämför denna tvärgående förberedelse med koronal skivning när det gäller kvalitet på inspelningar och bevarande av morfologiska funktioner i registrerade nervceller.
Transcript
Det övergripande målet med denna procedur är att förbereda friska akuta skivor från dorsala mellanliggande regionen hippocampus för långsiktiga inspelningar och återuppbyggnad av nervceller hos vuxna möss. Många laboratorier gillar vår, studerar dorsala hippocampus för sin roll i speciellt lärande och navigering. Vanliga tekniker som används för detta ändamål är beteendeexperiment, anatomisk spårning och regionala specifika manipuleringar.
Vi har utvecklat en hjärnsliceringsmetod för att kombinera elektrofysiologi med denna teknik för att möjliggöra direkt korrelation av invivodata inom videoinspelningar. Fördelen med detta protokoll är att det kombinerar ett enkelt förfarande för att få tvärgående skivor med användning av skyddande lösning för att förbättra hjärnvävnadens livskraft. Detta tillvägagångssätt är särskilt lämpligt när mogna djur används som i beteendeexperiment.
För att börja denna procedur, förbered bredvid diskbänken den nödvändiga utrustningen för det här avsnittet. Förbered på is en 150 milliliter bägare och två petriskålar i glas med 10 centimeters diameter vardera. Dra tre delar av linjerna tills botten av en petriskål av plast och placera skålen nära isbrickan.
Du behöver också lim och provhållaren för vibratome. Utrusta sedan operationsbänken med stor sax, liten sax, rundade spets pincett, fina spets pincett, en tunn metallspatel, en stor metallspatel och överföringspipetter. Skala petriskålarna med en skärlösning.
En maträtt för att utföra dissekeringen av huvudet och den andra för dissekering av hjärnan. I den senare, placera också ett filterpapper. Fyll även bägaren med 30 milliliter skärlösning.
Detta kommer att behövas för transcardial perfusion. Fyll vibratomebrickan med iskallt skärande lösning och håll all lösning syresatt med en carbogen bubblande enhet. Tillsätt den krossade isen gjord av den frusna satsen skärlösning till den kalla färska inskärningslösningen för att hålla temperaturen nere.
Var uppmärksam, för att hålla isen från bladet medan du skär. Nästan alla steg efter kapitationen utförs inom lösningarna. Detta hjälper till att hålla ämnesomsättningen syrebrist till ett minimum.
Förbered en inkubationskammare fylld med en skärlösning under konstant syresättning. Placera kammaren i ett förvärmt vattenbad vid 35 grader Celsius. Förbered en skiva lagringskammare med flera oberoende brunnar och fyll den med lagringslösning.
Håll den under konstant syresättning vid rumstemperatur. Om vävnaden uttrycker ett fluorescerande protein eller ett ljusaktiverat opsonin. Det rekommenderas att hålla kammaren i mörkret.
Till exempel inuti rutan. Efter att ha utfört transkardiell perfusion, placera musens huvud i Petri-skålen med den iskalla skärlösningen. Öppna huden med en fin sax för att exponera skallen.
Börja på foramen magnum, skär längs sagittal sutur tills du når nasofrontal sutur. Var noga med att dra upp saxen något för att undvika skador på hjärnan. Gör två laterala snitt i skallens botten.
Använd de rundade spets pincetterna för att dra upp parietalbenen. Var noga med att också ta bort hjärnhinnorna. Om de lämnas kan de skada hjärnan under extraktionen.
Använd den lilla spateln för att försiktigt lossa hjärnan från skallens botten. Med en liten spatel, lossa hjärnan från hjärnnerverna och överför hjärnan till ett litet filterpapper i den andra Petri-skålen. Skär hjärnan i halvor längs den längsgående sprickan med ett förkylt blad.
Separera de två halvkloten med den minsta spateln. Använd den största spateln för att överföra en halvklot till petriskålen i plast med dess mediala yta vänd nedåt. Justera parietal cortex med en av de parallella linjerna för att ha en referens för det andra snittet.
Använd ett filterpapper för att torka överflödig lösning. Placera bladet parallellt med linjerna och skär den ventrala delen av halvklotet. Denna plana yta kommer senare att limmas på provhållaren.
Återvänd halvklotet i den syresatt bomullslösningen i glas petriskålen och utför samma procedur på andra halvklotet. Placera en droppe cyanoakrylatlim på provhållaren vibrera och sprid det med en spatel för att skapa ett tunt skikt. Överför halvklotet till vibratomehållaren med ventralsidan nedåt med den rundade sidan av spateln.
Att starta denna skivning från parietal cortex skulle minska den tid som krävs för att samla dorsala regionen i hippocampus. Tillsätt några droppar kallskärningslösning för att stelna limet. Flytta provhållaren i vibratomebrickan och skär med lämpliga inställningar hjärnan tills regionen dorsala hippocampus är synlig.
Samla sedan skivorna med hjälp av en plastöverföringspipett. Överför varje skiva till inkubationskammaren och låt den vila i 12 minuter. Under tiden, fortsätt med att skära nästa skivor.
Efter 12 minuters inkubation överför du skivorna till förvaringskammaren. Och låt det vila tills experimentet börjar. För att visa renheten i vår förberedelse jämför vi det med en koronal förberedelse som vanligtvis används för att spela in från dorsala hippocampus.
Visas här är, differential interferens kontrast mikrograf förvärvas från det övre bladet av dentate gyrus i akuta skivor från två månader gamla möss. I den tvärgående skivan visade nervcellerna mestadels släta ytor och endast sannolikt kontrasterade gränser, indikeras av svarta pilar. Neuroner i Coronal-skivor uppträdde dock ofta kurs och visade starkt kontrasterade konturer, indikerade av vita pilar.
Detta tyder på bättre livskraft hos nervceller i den tvärgående skivan. Enligt detta intryck var den genomsnittliga tiden att försegla bildandet under plåstring i våra tvärgående skivor betydligt snabbare än i koronalskivorna. Som en allmän proxy för cellintegritet registrerar vi att vilomembranpotentialerna hos granulatceller och parvalbuminpositiva interneuroner som där betydligt mer depolariseras i båda celltyperna i koronal kontra tvärgående skivor.
Vilket i slutändan resulterade i betydligt fler celler som fick uteslutas i koronarpreparatet. Som granulat cell axoner kör i det tvärgående planet, återuppbyggnad av inspelade celler resulterade i hämtning av fullständig axonal arborization i vår förberedelse. Så var inte fallet i koronylskivor där axonerna lätt kan ha skurits av.
Dessutom tillät den morfologiska återuppbyggnaden av parvalbumin positiva inter neuroner i tvärgående skivor skildringen av omfattande axonal och dendritisk arborization, inklusive visualisering av en liten detalj, såsom dendritiska ryggrader. Sammantaget har vi presenterat en skivningsmetoder för att få tvärgående hippocampusskivor med hög neuronal livskraft för vuxna möss. Denna metod kan användas för att mäta elektrofysiologiska in vitro-undersökningar med anatomiska och beteendemässiga studier med fokus på den mellanliggande dorsala delen av hippocampus.
Tags
Neurovetenskap Nummer 170 Dorsal hippocampus dentate gyrus parvalbumin granulatcell interneuron patch-clamp inspelning tvärgåendeRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
