Embryomikroinjektion og knockout-mutant identifikation af CRISPR/Cas9-genomredigeret Helicoverpa Armigera (Hübner)

Bomuldsbollorm er et af de mest destruktive skadedyr på verdensplan. Genomredigering med CRISPR/Cas9-teknologien muliggør yderligere forskning i genfunktion og interaktion mellem forskellige gener i denne organisme. De to største fordele ved denne teknik er, at den har høj specificitet og er arvelig.

For at vælge sgRNA-målene skal du gå til CRISPR’s online hjemmeside for at søge efter mulige guidesider og exons tæt på de fem primære uoversatte regioner i genet. Indtast exon-sekvensen i tekstfeltet, og vælg målgenomet til Helicoverpa armigera. Vælg PAM-indstillingen for 20 BPNGG, og lad de andre indstillinger være på standardparametrene i henhold til brugermanualerne på webstedet.

Sammenlign de forudsagte guidesekvenser fra softwaren, og vælg en guidesekvens på 20 basepar, der indeholder en eller to guaniner nær det fem primære uoversatte område med den højeste forudsagte effektivitet og færrest uoverensstemmelser for at forbedre redigeringseffektiviteten og reducere redigering uden for målet. Til embryoforberedelse skal du vælge 50 raske individer fra tre dage gamle mænd og to dage gamle kvinder og blande dem i et rent netbur. Anbring et stykke fugtig bomuld indeholdende 10% sukkeropløsning i buret.

Dæk netburene med gasbind og fastgør gasbindet med et gummibånd. Sprøjt vand på gasbindet for at holde det fugtigt. Skær en sort klud i en passende størrelse og udskift den fugtige gasbind med denne sorte klud for at muliggøre fri ægstilling i 30 minutter.

Indsæt dobbeltsidet tape på et mikroskopdias. Brug tang til at indsætte pletterne med æg i træk på overfladen af det dobbeltsidede bånd. Tryk på margenen på hvert plaster for at sikre, at de klæber fast til båndet.

Saml 50 til 100 æg pr. Mikroskop dias. Før mikroinjektion skal du holde mikroskopet glide på is for at forsinke udviklingen af embryoner. Forbered nålen ved at trække i et kapillærglas ved hjælp af en mikropipettetrækler som beskrevet i tekstmanuskriptet.

Slib nålespidsen ved hjælp af en mikrokværn til en skarpkantet spids. Forbered injektionsopløsninger ved at tilsætte to mikroliter kommercialiseret Cas9-protein og sgRNA til RNace-frit vand i et PCR-rør for at opnå 10 mikroliter volumenblanding. Bland godt ved pipettering og læg det på is.

Indstil parametrene for den elektroniske mikroinjektor. Læg to mikroliter af blandingen i en nål ved hjælp af en mikrolæsserpipettespids, og udtøm så meget resterende luft i spidsen af nålen som muligt. Tilslut injektionsnålen til en mikromanipulator, og sørg for en tæt forbindelse mellem de to dele.

Placer et dias i en petriskål og læg det på mikroskopets scene. Indsæt forsigtigt nålespidsen i den øverste halvkugle af et embryo i en 45 graders vinkel. Tryk på pedalen for at levere blandingen ind i embryoet, hvilket fører til en lille udvidelse af embryoet.

Træk nålen straks tilbage fra embryoet og flyt petriskålen med den ene hånd, indtil det næste embryo er i nærheden af nålen. Mindst 300 embryoner injiceres efter samme procedure for at sikre en tilstrækkelig udklækningsmængde. Dæk låget på petriskålene efter injektion.

Når embryonernes overfladefarve er blevet mørkere, skal du lægge kunstig kost i petriskålen omkring mikroskopets dias. Forbered 24-brønds kulturplader og fyld hver brønd til 1/3 af dens volumetriske kapacitet med kunstig kost. Pluk rugelarven ud ved hjælp af en lille pensel og overfør dem til kulturpladen med 24 brønde, således at en brønd har en larve.

Når larven vokser til det tredje instar-stadium, skal du overføre dem til en ny glasdugtil ethrae. Overfør de nyligt lukkede G-zero mandlige voksne og vildtype kvindelige voksne til et frisk netbur i et lige forhold. Forsyn dem med 10% sukkeropløsning faldet i bomuldskugler.

Bageste insekter ved hjælp af rutinemæssige metoder indtil hvalpen af G-one. Brug tang til forsigtigt at fjerne et bagben og læg hvert ben i et Lysing Matrix-rør. Homogeniser bagbenet ved hjælp af en vævshomogenisator.

Uddrag det genomiske DNA fra den homogeniserede prøve ved hjælp af et kommercielt gDNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger. Forstærk gensegmentet ved hjælp af genolysningsprimere og PCR-reaktionsbetingelserne fra tekstmanuskriptet. Bekræft genotypen med en gensekventeringstjeneste.

Sæt G-en individer af samme genotype i et netbur, selv krydse G-one afkom og fortsæt med at screene ved hjælp af de samme metoder. Målstedet for genet af interesse var placeret i sin anden exon. Dette sted blev stærkt bevaret, og målbåndsfragmentet af syntetiseret sgRNA blev bekræftet ved anvendelse af agarosegelelektroforese.

Den mutante påvisning af et enkelt sgRNA-mål blev udført ved at sekventere PCR-produkterne fra G-one-forældreenheder. Effektiviteten af at anvende ikke-overlappende sgRNA-par på tværs af forskellige exoner blev påvist, da den store deletion af mutanterne let kunne skelnes fra vildtypepanderne. Efter opnåelse af et vist antal mutante individer kan elektrofysiologiske eller adfærdsmæssige eksperimenter udføres for at afklare genfunktion og interaktion mellem forskellige gener.