Biochemistry
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具有可移动XY阶段的平台孵化器：实现蛋白质细胞内快速光化学氧化的新平台
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Summary May 17th, 2021
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一种新的静态平台用于利用一种称为蛋白质细胞内快速光化学氧化（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术，对原生细胞环境中的蛋白质结构和相互作用部位进行特征。
Transcript
这种方法为当今苛刻的生物学问题提供了解决方案。通过细胞内FPOP实验，我们可以研究蛋白质-脂蛋白相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用位点和构象变化区域。这项技术的优点是使用基于六井板的自动IC-FPOP平台，使生长细胞和在激光下进行细胞内FPOP研究成为可能。
这种方法可用于制药和生物技术行业，以及主要的学术和临床研究机构，特别是研究蛋白质动力学的大学的生物研究人员。首先，将平台孵化器从定位阶段拧开，并断开温度、气体和加湿器线路。用70%乙醇喷洒孵化器，并将其放置在细胞培养罩中。
从平台孵化器中取出六井板，固定板的原始盖子，并用显微镜确认细胞的结合，然后将带汇流细胞的六井板放回平台培养罩内的平台孵化器中。通过嵌入式端口将管子冲洗到井壁上，并在每个井中插入三个预切的 Tygon 管，并使用自定义的 3D 打印环固定它们。为泵取款准备集成软件脚本。
使用一个永久泵从所有六口井中完全去除细胞介质。在其他三个灭菌泵的每个通道中，主要溶剂，然后将过氧化氢和淬热缓冲液注入各自的交替管中，直到试剂到达孵化器端口。确认激光束已正确倾斜，并不受约束地到达孵化器。
使用外部传感器检查激光能量。确认光束对齐后，准备泵输液的集成软件脚本。以每分钟35毫升的速度将200毫升过氧化氢注入第一口井。
按激光软件的启动按钮，在 5 秒标记下触发时间机上 11 秒标记的脉冲。以每分钟35毫升的速度将125毫升淬奇溶液注入激光脉冲后的第一口井中。手动移动定位阶段，使下一口井与激光束对齐，并重复所有油井的过程。
在细胞培养罩中，使用细胞刮刀将每个井中的细胞转移到单独的 15 毫升圆锥管中。离心机在1200倍G五分钟。丢弃超自然物，在RIPA裂解缓冲器的100微升中恢复细胞。
将细胞转移到单个 1.2 毫升聚丙烯管中。将所有样品冷冻在液氮中，并放在零下80度的冰柜中，直到使用。要本地化FPOP修饰，使用液相色谱串联质谱分析分析消化细胞赖苏酸盐，然后计算修改程度。
为了确认平台孵化器条件足以在激光平台进行细胞培养，GCaMP2 暂时转入 HEK293T，并通过荧光成像评估了两个板的转染效率。进行了路西法酶检测，以量化转化效率。将流程系统中标记的 HEK293T 单元中的 FPOP 修改与平台孵化器中标记的 FPOP 修改进行比较。
平台孵化器在修改的蛋白质数量和这些蛋白质的总 FPOP 覆盖率方面都优于流动系统。在流动系统中，检测到两个经过修饰的肽，提供有限的结构信息。然而，在平台孵化器中检测到跨越行为序列的五种修改肽。
此处显示了在两个系统中具有修改蛋白的代理的串联MS光谱和未修改的肽行为。平台孵化器样品中的 FPOP 修改残留物包含 12 个修改后的残留物、流系统中的 3 个修改残留物和 1 个重叠的修改残留物。LC-MS MS 分析显示，平台孵化器中的体内 FPOP 对 792 种蛋白质进行了修改，而与流系统修改的 545 种蛋白质相比。
必须使细胞处于无菌状态。始终将平台孵化器带入无菌细胞培养罩中，插入所有必要的六井板、管子和环。这确保了实验的完整性。
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