Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Immunostaining av helmonterade näthinnor med CLARITY Tissue Clearing Method
Chapters
Summary March 6th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för att anpassa CLARITY-metoden för hjärnvävnaderna för helmonterade näthinnor för att förbättra kvaliteten på standard immunohistokemisk färgning och högupplöst bildbehandling av retinal nervceller och deras subcellulära strukturer.
Transcript
Detta protokoll möjliggör undersökning av den fina morfologi av retinal nervceller och kan ge insikt i cellulära och subcellulära morfologiska förändringar som uppstår i sjukdom stater. Denna metod förbättrar avsevärt den optiska transparensen i näthinnan och möjliggör högupplöst, tredimensionell avbildning, kretsledningar och fina subcellulära strukturer av näthinneneuroner i hormon näthinnepreparat. Enucleate musögonen med böjda tångar och överför dem till en liten Petri-maträtt med 0,1 M PBS.
Peta ett litet hål längs hornhinnans sclera-korsning med nålen under dissektionsmikroskopet och överför sedan ögat till 4% kraftformigdehyd i en timme. Överför ögat tillbaka till en maträtt med PBS. Använd dissekeringssaxen under ett dissekeringsmikroskop för att skära hela vägen runt corneoscleral-korsningen.
Ta bort hornhinnan och linsen. Skär sedan av den vid basen av synnerven och skala försiktigt av sclera med tång för att isolera näthinnan. Gör fyra små snitt jämnt runt näthinnan och använd en fin spetsborste doppad i PBS för att lägga den platt GCL-sida ner i klöverliknande form på ett litet fyrkantigt snitt från nitrocellulosafilterpapper.
Plocka upp hörnet av nitrocellulosapapperet med tång och placera det i en 48-brunnsplatta med 4% effekt formaldehyd i en timme, överför sedan filterpapperet och näthinnan till en brunn med PBS och tvätta tre gånger i fem minuter vardera. Tina upp A4P0-lösningen på is. Överför sedan näthinnan till A4P0-lösningen och inkubera över natten vid fyra grader Celsius med mild agitation.
Tillsätt vegetabilisk olja i brunnen för att helt täcka A4P0-lösningen. Inkubera i ett vattenbad vid 40 grader Celsius i tre timmar utan skakningar. Tvätta sedan tre gånger i PBS i fem minuter per tvätt.
Inkubera näthinnan i 10% natriumdupcylsulfat vid 40 grader Celsius i två dagar med mild skakning och överför sedan filterpapperet och näthinnan till PBS med Triton X-100 och tvätta fem gånger i 90 minuter per tvätt. Efter den slutliga tvätten, lagra näthinnan vid fyra grader Celsius i PBS-T med 0,01% natriumazid eller flytta direkt till immunfärgning. Ta bort näthinnan från filterpapperet genom att försiktigt skala av den med en fin spetsborste i PBS-T.
Inkuberas i primär antikropp utspädd i blockerande lösning i två dagar vid 40 grader Celsius med mild skakning. Efter inkubationen, tvätta fem gånger i 90 minuter i PBS-T. Inkubera näthinnan med lämpliga sekundära antikroppar utspädda i blockeringslösning i två dagar vid 40 grader Celsius med skonsam skakning.
Skydda proverna mot ljus under resten av proceduren. Tvätta näthinnan fem gånger i 90 minuter i 0,02 M fosfatbuffert. Inkubera slutligen näthinnan i sorbitol-baserade brytning index matchning lösning vid 40 grader Celsius över natten med mild skakning.
Skissera en glaskåpa slip med en fin spets permanent markör för att markera en fyrkantig gräns på baksidan av en glasmikroskop glid. Vänd på rutschkanan och använd en spruta för att spåra gränsen med en tunn linje silikonfett på bildens framsida. Lämna ett litet mellanrum i ett hörn för överflödig monteringslösning för att komma ut.
Överför näthinnan till mitten av det avgränsade området och placera den med en fin spetsborste så att den ligger platt med fotoreceptorsidan mot glasrutschbanan. Pipetten är cirka 60 mikroliter sRIMS så att den täcker den utplattade näthinnan och sträcker sig till ett hörn av höljet. Se till att näthinnan förblir platt och på plats.
Applicera täckspingen, börja från hörnet med sRIMS och sänk den långsamt tills den vidrör fettet på alla sidor. Placera en stapel med tre täckslipsar på varje sida av den monterade näthinnan som distans. Använd långsidan på en annan bild för att trycka ner täcksnederdelen så att fästet är platt och jämnt.
Förvara rutschkanorna på fyra grader Celsius tills de avbildningar. Börja med att placera bilden på mikroskopstadiet och lokalisera provet. För att få Z-staplade bilder av prover, fokusera först på signalen i varje kanal individuellt och ställ in exponeringstiden eller skanningshastigheten för fluorescens- respektive konfokala mikroskop.
Ställ in intervallet för Z-stacken antingen genom att manuellt ställa in brännplanet högst upp och längst ned i önskat intervall eller genom att ställa in mittpunkten och sedan ange ett intervall runt mittpunkten. Justera stegstorleken eller antalet segment efter behov. Ta bilden och spara originalfilen.
Exporteras sedan som en TIF-fil eller ett annat önskat format. Använd bildanalys, valfri programvara för att justera ljusstyrkan och kontrasten i varje kanal tills optimal klarhet uppnås i både de enskilda bilderna och den tredimensionella renderingen av Z-stacken. När den behandlades med det modifierade CLARITY-protokollet observerades fullständig optisk genomskinlighet genom näthinnans tjocklek jämfört med icke-bearbetade kontrollhinner.
Z staplade bilder för Arrestin-märkta koner i ONL, TH-märkta DAC i INL och RBPMS-märkta RGCs i GCL visas här. Den relativa platsen för nervceller i hela tjockleken på näthinnan observerades i överlagringsbilden. TH färgning och KLARHET bearbetade hela Mount näthinnorna jämfördes med bilder från standard förberedelse.
Dendriter och axon-liknande processer av DACs avslöjades tydligare i en klarhet bearbetade näthinnan än i en standard näthinnan. Axon-liknande processer av DACs uppvisade kompletta ringliknande strukturer i en klarhet näthinna jämfört med en standard näthinnan. Ringliknande strukturer av CLARITY näthinnan tas med fluorescensmikroskopi var nästan identiska med de som observerats med confocal mikroskopi.
De axonliknande processerna gick också mot den yttre näthinnan. Immun färgning mot GluA2 och PSD-95 visade distinkt puncta, avslöjar enskilda GluA2 som innehåller AMPA-receptorer och förmodade post synaptiska platser, respektive. En överläggsbild visade lite puncta på DAC-processer.
Punkterna för försättande samlokalisering presenterades i XZ, YZ och XY-plan och TH samlokalisering tydligt med både GluA2 och PSD-95. Det är viktigt att näthinnan förblir platt under hydrogelpolymeriseringsprocessen så att den rensade näthinnan kan ligga platt för monterings- och bildbehandlingsprocessen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
