Immunostaining av helmonterade näthinnor med CLARITY Tissue Clearing Method
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att anpassa CLARITY-metoden för hjärnvävnaderna för helmonterade näthinnor för att förbättra kvaliteten på standard immunohistokemisk färgning och högupplöst bildbehandling av retinal nervceller och deras subcellulära strukturer.
Abstract
Vävnad hydrogel delipidation metod (CLARITY), ursprungligen utvecklat av Deisseroth laboratoriet, har modifierats och används ofta för immunostaining och bildbehandling av tjocka hjärnan prover. Denna avancerade teknik har dock ännu inte använts för helmonterade näthinner. Även om näthinnan är delvis genomskinlig begränsar dess tjocklek på cirka 200 μm (hos möss) fortfarande penetrationen av antikroppar i den djupa vävnaden samt minskar ljuspenetrationen för högupplöst avbildning. Här anpassade vi CLARITY-metoden för helmonterade musretinor genom att polymerisera dem med en akrylamidmonomer för att bilda en nanoporös hydrogel och sedan rensa dem i natrium dodecylsulfat för att minimera proteinförlust och undvika vävnadsskador. CLARITY-bearbetade näthinnor var immunostained med antikroppar för retinal nervceller, stödjeceller och synaptiska proteiner, monterade i ett brytning index matchande lösning och avbildas. Våra data visar att CLARITY kan förbättra kvaliteten på standard immunohistochemical färgning och bildbehandling för retinal nervceller och stödjeceller i hela montering beredning. Till exempel förbättrades 3D-upplösning av fina axon-liknande och dendritiska strukturer av dopaminerg amacrine celler mycket av CLARITY. Jämfört med icke-bearbetade helmonterade näthinnemat kan CLARITY avslöja immunostaining för synaptiska proteiner såsom postsynaptiskt densitetsprotein 95. Våra resultat visar att CLARITY gör näthinnan mer optiskt transparent efter avlägsnandet av lipider och bevarar fina strukturer av näthinneneuroner och deras proteiner, som rutinmässigt kan användas för att erhålla högupplöst bildbehandling av näthinneneuroner och deras subcellulära strukturer i hela monteringsberedningen.
Introduction
Ryggkotor näthinnan är kanske den mest tillgängliga delen av centrala nervsystemet (CNS), och det fungerar som en utmärkt modell för att studera hjärnans utveckling, struktur och funktion. Fem klasser av nervceller i näthinnan fördelas i tre nukleära lager åtskilda av två plexiforma lager. Det yttre kärnskiktet (ONL) består av klassiska fotoreceptorer (stavar och koner) som omvandlar ljus till elektriska signaler. Elektriska signaler bearbetas av nervceller i det inre kärnskiktet (INL), inklusive bipolära, horisontella och amacrine celler, och överförs sedan till retinal ganglion celler (RGCs) i ganglion cell skiktet (GCL). RGCs är utdataneuroner i näthinnan, med axonerna som projicerar till hjärnan för att bidra till bildbildande och icke-bildbildande visuell funktion. Dessutom ger tre typer av gliaceller (Mullerceller, astroglia och mikroglia) näringsämnen till nervceller och skyddar nervceller från skadliga förändringar i deras extracellulära miljö.
En specialiserad subpopulation av amacrine celler producerar och släpper dopamin, en viktig neuromodulator i CNS, omkonfigurera retinal neurala kretsar under ljus anpassning1,2. Dopaminergiska amacrine celler (DACs) har en unik egenskap hos morfologiska profiler. Deras somata ligger i det proximala INL med dendriter som förargar i den mest distala delen av det inre plexiformskiktet (IPL). Axon-liknande processer av DACs är unmyelinated, tunn och lång, glest förgrenad och bär varicosities (platserna för dopamin release). De bildar en tät plexus med dendriter i IPL, inklusive ringliknande strukturer runt somata av AII amacrine celler. Axonerna löper också genom INL mot OPL och bildar en centrifugalväg över näthinnan3. Vi har visat att DAC processer uttrycker receptorer som svar på glutamat release från presynaptic nervceller, inklusive bipolära celler och inneboende ljuskänsliga retinal ganglion celler (ipRGCs)4,5,6. Det är dock oklart om glutamatreceptorer uttrycker på axonerna, dendriterna eller båda eftersom de är avskurna i vertikala näthinnesektioner och inte kan särskiljas från varandra5,6. Immunostaining måste utföras i helmonterade näthinner för att avslöja tredimensionell förgrening av DACs och förekomsten av glutamatreceptorer på subcellulära fack. Även om näthinnan är relativt genomskinlig är tjockleken på en mus helmonterad näthinna cirka 200 μm, vilket begränsar penetrationen av antikroppar i den djupa vävnaden samt minskar ljuspenetrationen för högupplöst avbildning på grund av vävnadsljusspridning. För att övervinna dessa begränsningar anpassade vi den immunostaining kompatibla vävnad hydrogellipidation metod (CLARITY) utvecklats nyligen för tjocka hjärnsektioner till hela mount mus näthinnor7.
CLARITY-metoden utvecklades ursprungligen av Deisseroth-laboratoriet för immunostaining och avbildning av tjocka hjärnprover7. Den använder ett starkt tvättmedel, natriumdidcylsulfat (SDS) och elektrofores för att ta bort lipidkomponenterna (som orsakar vävnadsljusspridning), vilket lämnar proteinerna och nukleinsyrorna på plats. De borttagna lipiderna ersätts med en genomskinlig byggnadsställning som består av hydrogelmonomerer som akrylamid för att stödja den återstående proteinstrukturen. Den rensade vävnaden kan märkas via immunohistokemi och avbildas med väsentligt ökat ljuspenetrationsdjup genom vävnaden (upp till flera millimeter under vävnadsytan). Sedan dess har CLARITY-metoden optimerats och förenklats av flera forskargrupper8,9,10. Ett modifierat CLARITY-protokoll använder en passiv clearingteknik för att undvika eventuella vävnadsskador som orsakas av elektrofores för att rensa hela hjärnan och andra intakta organ11. Denna metod har dock ännu inte tillämpats på helmonterade näthinner. Här anpassade vi den passiva CLARITY-tekniken för helmonterade näthinner för att göra dem mer transparenta för immunohistokemi och avbildning. Vi fann att en majoritet av de retinal proteiner som testades bevarades under denna process för immunohistokemi. Med hjälp av brytning index matchningslösningen kunde vi avbilda näthinneneuroner över den cirka 200 μm tjockleken från ONL till GCL i helmonterade näthinnor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ändring av CLARITY-protokollet för helmonterade näthinner.
Vi har förenklat CLARITY-protokollet för att uppnå adekvat polymerisation utan behov av en vakuumevakuerings- eller uttorkningskammare, som används i de flesta tidigarestudier 7,9,11. Polymerisationsprocessen hämmas av syre, vilket kräver att provet isoleras från luft under protokollets polymerisationssteg. Men i stället för att avgasa med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Bing Ye, Nathan Spix och Hao Liu för teknisk support. Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) och Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
