Journal
/
/
Udforskning af m6A og m5C Epitranscriptomes om virusinfektion: et eksempel med HIV
JoVE Journal
Biology
Author Produced
This content is Free Access.
JoVE Journal Biology
Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Udforskning af m6A og m5C Epitranscriptomes om virusinfektion: et eksempel med HIV

3,005 Views

14:40 min

March 05, 2022

DOI:

14:40 min
March 05, 2022

7 Views
, ,

Transcript

Automatically generated

Hej, i denne video vil vi vise dig, hvordan du udforsker m6A og m5C epitranscriptomes ved virusinfektion. For at starte eksperimentet skal du bruge 50 millioner celler til de ikke-inficerede og 50 millioner til den inficerede tilstand. For at opnå en høj kvalitet datasæt ved analyse, du bliver nødt til at opnå en universel infektion.

Her inficerer vi disse celler med en HIV-baseret vektor og måler den viralt kodede GFP af FACS. I dette tilfælde havde vi 80% af inficerede celler og fortsatte med arbejdsgangen startende med den samlede RNA-ekstraktion. Vi delte cellerne i 10 millioner hver og lysede dem i 1 mL Trizol.

Vi tilføjede derefter 200 mikroliter kloroform til cellelyset og blandet ved inversion. På dette tidspunkt lader vi lysatet sidde i tre minutter ved stuetemperatur og centrifugere derefter alle prøver ved høj hastighed i 15 minutter ved fire grader. Du forventer at se en faseadskillelse i tre forskellige faser, som det er vist her.

RNA sidder i den øverste fase, så overfør forsigtigt den vandige fase til et frisk rør ved at være opmærksom på ikke at overføre det organiske lag. På dette tidspunkt tilsættes 0,5 mL isopropanol til den vandige fase og blandes omhyggeligt ved inversion. Prøver kan derefter inkuberes en time ved 80 grader for at sikre RNA nedbør.

Ved centrifugering ved høj hastighed, bør du være i stand til at se en dejlig RNA pellet som det er vist her. Kassér forsigtigt supernatanten enten ved inversion eller ved pipettering, idet du er opmærksom på ikke at forstyrre pelleten. Vask derefter RNA pellet med en mL på 75% molekylær kvalitet ethanol.

Og hvirvle prøven kort. Ved centrifugering skal du sørge for at hente en dejlig hvid RNA pellet. Kassér supernatanten og lad RNA-pelleten tørre i 15 minutter ved stuetemperatur.

Resuspend hver pellet i 20 mikroliter vand og pool alle prøve fra samme tilstand sammen. Total RNA er nu klar til mRNA isolation ved poly-A udvælgelse. For hver prøve på 75 mikrogram RNA skal der forberedes 200 mikroliter oligo-DT magnetiske perler og vaskes i en mL bindende buffer.

Placer røret på en magnetisk stativ og lad perlerne til at binde sig til magneten under en blanding. Kassér supernatanten, og gentag proceduren for en anden vask. Fjern derefter perlerne fra de magnetiske stativer og genbrug dem forsigtigt i 100 mikroliter bindende buffer.

På dette tidspunkt skal du forberede RNA-prøven ved at dividere dem i 75 mikrogram RNA pr. aliquot, der er suspenderet i 100 mikroliter vand. Tilsæt 100 mikroliter bindende buffer og inkuber i to minutter ved 65 grader. Drej derefter prøverne ned og inkuberes på is.

Tilsæt derefter 100 mikroliter af vaskede magnetiske perler til hver RNA-prøve og lad binding på et roterende hjul i 15 minutter ved stuetemperatur. Ved inkubation skal du placere røret tilbage i et magnetisk rack og lade dem inkubere i et minut. Derefter inddrive supernatant i et frisk rør og holde det til side for en anden runde af isolation.

Vask perlerne to gange med 200 mikroliter vaskebuffer og fortsæt derefter til elution. For at elute poly-A udvalgte RNA fra de magnetiske perler, tilføje 20 mikroliter af iskold TRIS HCl til hver prøve og pipette omhyggeligt. Inkuber derefter dine prøver ved 80 grader i to minutter for at frigøre RNA fra perlerne.

Overfør supernatanten, der indeholder poly-A udvalgte RNA til et frisk rør, idet man er forsigtig med at undgå perleroverførsel. Elutionstrinnet samt isolationstrinnet skal gentages to gange for at øge mRNA-udbyttet. mRNA er nu klar til enten at komme ind i meRIP-Seq-rørledningen ved fragmenteringstrinnet eller gå direkte til bisulfitkonvertering.

Det første skridt til at komme ind i meRIP-Seq-rørledningen består i mRNA-fragmentering. Til dette har du brug for fem mikrogram mRNA opdelt i aliquots af 18 mikroliter i 0,2 ML rør. For at sikre ensartede data er det afgørende at arbejde hurtigt og med kun få eksempler på det tidspunkt.

Til dette eksperiment er fragmenteringen blevet optimeret for at opnå fragment af en størrelse mellem 115 og 200 nukleotider. Derefter tilsættes to mikroliter fragmentering reagens til hvert rør, der indeholder 18 mikroliter af mRNA er omhyggelig med at deponere dråben på rørvæggen. Skru ned for alle prøver for at muliggøre kontakt mellem reagenset og RNA på samme tid og inkuberes ved 70 grader i 15 minutter.

Når inkubationen er overstået, skal reaktionen stoppes ved at tilsætte to mikroliter på 0,5 M EDTA. På dette tidspunkt kan du rense dit fragmenterede mRNA med din valgte metode og fortsætte til en RNA-kvalitetskontrol ved fragmentanalysator. Dette trin er valgfrit, men det vil gøre det muligt at vurdere størrelsen af fragmentet, før du aktiverer RNA nedbør.

Som du kan se her i fjerde vognbane, får vi for både vores prøve fragment på omkring 150 nukleotid hver. Vi fortsatte derefter med meRIP-Seq. Det første trin består i par A /G magnetiske perler med enten anti-m6A antistoffer eller IgG kontrol.

For hver reaktionsplan overføres 25 mikroliter magnetiske perler til et friskrør. Bemærk, at du skal bruge mindst en m6A-specifik tilstand og en kontroltilstand. Vask hver 25 mikroliter af perler med 250 mikroliter IP-buffer.

Forsigtigt genbruge perlerne ved pipetter op og ned og placere røret på den magnetiske rack i et minut for at tillade perle adskillelse. Fjern og kassér supernatanten, vær opmærksom ved ikke at aspirer de magnetiske perler og gentag vasketrinnet en gang. Derefter genbruges de magnetiske perler i 100 mikroliter IP-buffer pr. hver 25 mikroliter af original mængde perler.

Forbered og mærk et rør pr. betingelse. I vores tilfælde vil vi have to rør til den inficerede tilstand, En til m6A og en til IgG-kontrol og to rør til den ikke-inficerede tilstand. Tilsæt derefter 100 mikroliter vaskede perler i hvert rør.

Perler er nu klar til at blive kombineret med specifikke antistoffer eller IgG kontrol. Tilsæt fem mikrogram af enten specifikke anti-m6A antistof eller anti-IgG kontrol antistof til hvert rør, der indeholder 100 mikroliter af vaskede magnetiske perler. Tillad antistofperler bøjning ved at inkubere røret 30 minutter på et roterende hjul.

I mellemtiden skal du fortsætte med prøveforberedelse. For hver planlagt tilstand, enten m6A-specifik eller IgG-kontrol, vil dit udgangsmateriale være 2,5 mikrogram fragmenteret mRNA suspenderet 100 mikroliter vand. Hvis du vil have et endeligt reaktionsvolumen på 500 mikroliter, skal du tilsætte 295 mikroliter vand til hver prøve.

Tilsæt derefter fem mikroliter RNAase-hæmmer koncentreret ved 40 enheder pr. mikroliter for en samlet mængde på 200 enheder pr. prøve og bland forsigtigt. Endelig tilsættes 100 mikroliter af 5X koncentreret IP buffer til hvert rør. Prøverne er nu klar til immunudfældningsreaktionen.

Hent de magnetiske perler kombineret med antistof fra det roterende hjul og drej dem ned. Tilsæt derefter 500 mikroliter af de tidligere forberedte prøver til hver 100 mikroliter af perler kombineret med de specifikke antistoffer. Bland forsigtigt ved pipetter op og ned flere gange for helt at genbruge perlerne.

Inkuber dem eller din meRIP reaktion på et roterende hjul ved fire grader i løbet af to timer. Når inkubationen er overstået, drej ned hvert rør og læg dem på et magnetisk rack i et minut for at tillade perleadskillelse. Fjern derefter den ubundne brøk og læg den på et nyt rør og hold den til yderligere analyse, hvis det er nødvendigt.

Fjern magneten fra stativet og genbrug alle prøver i 500 mikroliter IP-buffer. Brug hver prøve omhyggeligt ved at pipetter op og ned. Indsæt magneten på stativet, inkuber i et minut, og fjern derefter forsigtigt supernatanten.

Gentag vasken to gange, og fortsæt derefter med elution. For hvert par prøver, m6A specifik og kontrol, forberede 225 mikroliter af elution buffer indeholdende 20 millimolar af renset m6A. Tilsæt derefter 100 mikroliter elutionbuffer pr. prøve.

Inkuber alle prøve en time ved fire grader på en rocker. Derefter samles alle m6A beriget RNA prøve i et frisk rør og fortsætte med en anden runde af elution. Rense m6A beriget RNA med din valgte metode Og så på dette tidspunkt prøver er klar til bibliotek forberedelse og sekventering.

For at undersøge m5C-ændringen bruger vi bisulfitkonvertering. Start eksperimentet med 500 nanogram poly-adenyleret RNA. Selvom det er valgfrit, vil tilføjelse til din prøve 500 pikogram af poly-A udtømt RNA for at sikre ribosomale repræsentation og 0,5 mikroliter af kommercielt tilgængelige syntetiske sekvens giver dig mulighed for at vurdere bisulfit konverteringsfrekvens ved sekventering.

Juster prøven til et endeligt volumen på 20 mikroliter i vand, og tilsæt derefter 130 mikroliter RNA-konverteringsreagens til hver prøve. Bland forsigtigt ved pipetter op og ned og spin ned alle prøve for at sikre, at der ikke er dråber tilbage på siden af rørene. Inkuberes alle prøver i en PCR-maskine i tre cyklusser af denaturering 70 grader i fem minutter og bisulfitkonvertering ved 54 grader i løbet af 45 minutter.

Udfør deaminering i kolonnen ved at tilføje direkte på en tom kolonne, 250 mikroliter RNA-bindingsbuffer, 150 mikroliter af din bisulfitkonomerede prøve. Bland prøven ved pipetter op og ned, men vær opmærksom ved ikke at røre kolonnefiltrene. Der tilsættes 400 mikroliter 95-100% ethanol til den prøve RNA-bindingsbufferblanding, der er direkte i kolonnen.

Luk hætten og bland straks ved inversion. Skru ned for prøven i 30 sekunder, og kassér gennemstrømningen. Vask din kolonne med vaskebuffer, og tilsæt derefter 200 mikroliter desulfoneringsopløsning til midten af hver kolonne.

Inkuber alle dine prøver i 30 minutter ved stuetemperatur. Drej prøven ned i 30 sekunder, og fortsæt derefter med to vaskerunder. Tilsæt 400 mikroliter vaskebuffer til hver prøve, centrifuge i 30 sekunder ved fuld hastighed og kassér flow-through.

Placer kolonnen i et nyt tomt rør og elute bisulfit konverteret RNA i 20 mikroliter vand. Kontroller bisulfitkonverteringseffektiviteten ved RT-qPCR, og fortsæt derefter til biblioteksforberedelse og -rækkefølge. Ved bioinformatisk analyse er her et eksempel på resultater, som du kan opnå med denne arbejdsgang.

Her sammenligner vi epitranscriptomet af HIV-inficerede celler versus ikke-inficerede celler. efter infektion. I A-panelet kan du se de resultater, vi får ved at udforske m6A epitranscriptom.

I denne graf plotter vi m6A beriget læser på meRIP-Seq analyse. Vi kan godt se, at en zinkfinger er hypermethyleret 24 timer efter infektionen. Vi udførte den samme type analyse for m5C epitranscriptom undersøgelse i panel B.In denne graf, hver ikke-methyleret cytosin vises i rødt, mens andelen af cytosin, der er blevet m5C methyleret er vist med blåt.

Som du kan se, PHLPP1, alle tre cytosiner, der er hyper-methyleret 24 timers post-HIV-infektion. Samlet set denne arbejdsgang gør det muligt at undersøge både M6A og m5C epitranscriptom af inficerede celler og kan anvendes som sådan på viruspartikler samt. Forståelse af virusinfektion er i stand til at ændre værten epitranscriptomic landskab vil give os adgang til et nyt lag af regulering.

Undersøgelsen af differentierede methylerede udskrifter på virusinfektion vil naturligvis give en værdifuld ressource for nye terapeutiske intervention. På linket her nedenfor kan du finde vores open access ressource til undersøgelse af differentieret methyleret udskrift om hiv-infektion over tid.

Summary

Automatically generated

RNA-modifikationernes rolle i virusinfektioner er lige begyndt at blive undersøgt og kunne fremhæve nye virale interaktionsmekanismer. I dette arbejde leverer vi en pipeline til at undersøge m6A og m5C RNA ændringer i forbindelse med virusinfektioner.

Read Article