Journal
/
/
Utforske m6A og m5C Epitranscriptomes ved virusinfeksjon: et eksempel med HIV
JoVE Journal
Biology
Author Produced
This content is Free Access.
JoVE Journal Biology
Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Utforske m6A og m5C Epitranscriptomes ved virusinfeksjon: et eksempel med HIV

3,005 Views

14:40 min

March 05, 2022

DOI:

14:40 min
March 05, 2022

7 Views
, ,

Transcript

Automatically generated

Hei, i denne videoen vil vi vise deg hvordan du utforsker m6A og m5C epitranscriptomes ved virusinfeksjon. For å starte eksperimentet trenger du 50 millioner celler for de ikke-infiserte og 50 millioner for den infiserte tilstanden. For å få et datasett av høy kvalitet ved analyse, må du oppnå en universell infeksjon.

Her smitter vi disse cellene med en HIV-basert vektor og måler den viralt kodede GFP av FACS. I dette tilfellet hadde vi 80% av infiserte celler og fortsatte med arbeidsflyten som startet med total RNA-utvinning. Så vi delte cellene i aliquots på 10 millioner hver og lyse dem i 1 ml Trizol.

Deretter la vi til 200 mikroliter kloroform i cellelyset og blandet ved inversjon. På dette tidspunktet lar vi lysate sitte i tre minutter ved romtemperatur og deretter sentrifugere alle prøver med høy hastighet i 15 minutter ved fire grader. Du forventer å se en faseseparasjon i tre forskjellige faser, som vist her.

RNA sitter i den øvre fasen, så overfør forsiktig den vandige fasen til et friskt rør ved å være oppmerksom på ikke å overføre det organiske laget. På dette tidspunktet legger du til 0,5 ml isopropanol i den vandige fasen og blander forsiktig ved inversjon. Prøver kan deretter inkuberes en time ved 80 grader for å sikre RNA-nedbør.

Ved sentrifugering i høy hastighet, bør du kunne se en fin RNA pellet som vist her. Kast forsiktig supernatanten enten ved inversjon eller ved pipettering, vær oppmerksom på ikke å forstyrre pelletsen. Vask deretter RNA-pelletsen med en ml 75% molekylært etanol.

Og virvel prøven kort. Ved sentrifugering, sørg for at du henter en fin hvit RNA pellets. Kast supernatanten og la RNA-pelletsen tørke i 15 minutter ved romtemperatur.

Resuspend hver pellets i 20 mikroliter vann og basseng alle prøve fra samme tilstand sammen. Total RNA er nå klar for mRNA-isolasjon ved hjelp av poly-A-utvalg. For hver prøve på 75 mikrogram RNA, lag 200 mikroliter oligo-DT magnetiske perler og vask dem i en ml bindingsbuffer.

Plasser røret på et magnetisk stativ og la perlene binde seg til magneten under en blanding. Kast supernatanten og gjenta prosedyren for en ny vask. Fjern deretter perlene fra de magnetiske stativene og resuspender dem forsiktig i 100 mikroliter bindingsbuffer.

På dette tidspunktet forbereder du RNA-prøven ved å dele dem i 75 mikrogram RNA per aliquot resuspendert i 100 mikroliter vann. Tilsett 100 mikroliter bindingsbuffer og inkuber i to minutter ved 65 grader. Deretter snurrer du ned prøvene og inkuberer på is.

Tilsett deretter 100 mikroliter vaskede magnetiske perler til hver RNA-prøve og la innbinding på et roterende hjul i 15 minutter ved romtemperatur. Ved inkubasjon, plasser røret tilbake i et magnetisk stativ og la dem inkubere i ett minutt. Deretter gjenoppretter du supernatanten i et friskt rør og holder det til side for en andre runde isolasjon.

Vask perlene to ganger med 200 mikroliter vaskebuffer og fortsett deretter til elution. For å unngå poly-A valgt RNA fra de magnetiske perlene, tilsett 20 mikroliter iskald TRIS HCl til hver prøve og pipette nøye. Deretter inkuberer du prøvene dine ved 80 grader i to minutter for å frigjøre RNA fra perlene.

Overfør supernatanten som inneholder poly-A valgt RNA til et friskt rør, og vær forsiktig med å unngå perleroverbæring. Elution trinnet samt isolasjon trinn bør gjentas to ganger for å øke mRNA utbytte. mRNA er nå klar enten til å gå inn i meRIP-Seq-rørledningen på fragmenteringstrinnet eller gå direkte til bisulfittkonvertering.

Det første trinnet for å gå inn i meRIP-Seq-rørledningen består i mRNA-fragmentering. For dette trenger du fem mikrogram mRNA delt inn i aliquots på 18 mikroliter i 0,2 ml rør. For å sikre konsistente data er det viktig å arbeide raskt og med bare få utvalg på det tidspunktet.

For dette eksperimentet er fragmentering optimalisert for å oppnå fragment av en størrelse mellom 115 og 200 nukleotider. Tilsett deretter to mikroliter fragmenteringsreagens til hvert rør som inneholder 18 mikroliter mRNA, og vær forsiktig med å deponere dråpen på rørveggen. Spinn ned alle prøver for å tillate kontakt mellom reagenset og RNA samtidig og inkubere ved 70 grader i 15 minutter.

Når inkubasjonen er over, stopp reaksjonen ved å legge til to mikroliter på 0,5 M EDTA. På dette tidspunktet kan du rense din fragmenterte mRNA med din valgte metode og fortsette til en RNA-kvalitetskontroll av fragmentanalysator. Dette trinnet er valgfritt, men det vil tillate å vurdere størrelsen på fragmentet før du engasjerer RNA-nedbør.

Som du kan se her i fjerde kjørefelt, får vi for både prøvefragmentet vårt på rundt 150 nukleotid hver. Vi fortsatte deretter med meRIP-Seq. Det første trinnet består i par A / G magnetiske perler med enten anti-m6A antistoffer eller IgG-kontroller.

For hver reaksjonsplan, overfør 25 mikroliter magnetiske perler til et friskt rør. Vær oppmerksom på at du trenger minst en m6A-spesifikk tilstand og en kontrollbetingelse. Vask hver 25 mikroliter perler med 250 mikroliter IP-buffer.

Resuspend beads forsiktig ved å pipettere opp og ned og plassere røret på magnetstativet i ett minutt for å tillate perle separasjon. Fjern og kast supernatanten, vær oppmerksom på ikke å aspirere de magnetiske perlene og gjenta vasketrinnet en gang. Deretter resuspenderer de magnetiske perlene i 100 mikroliter IP-buffer per hver 25 mikroliter av originalt volum perler.

Forbered og merk ett rør per hver tilstand. I vårt tilfelle vil vi ha to rør for den infiserte tilstanden, En for m6A og en for IgG-kontroll, og to rør for den ikke-infiserte tilstanden. Tilsett deretter 100 mikroliter vaskede perler i hvert rør.

Perler er nå klare til å bli kombinert med spesifikke antistoffer eller IgG-kontroller. Tilsett fem mikrogram enten spesifikt anti-m6A antistoff eller anti-IgG kontroll antistoff til hvert rør som inneholder 100 mikroliter vaskede magnetiske perler. Tillat antistoffperler ved å inkubere røret 30 minutter på et roterende hjul.

I mellomtiden fortsetter du med prøveforberedelse. For hver planlagte tilstand, enten m6A-spesifikk eller IgG-kontroll, vil startmaterialet ditt være 2,5 mikrogram fragmentert mRNA resuspendert 100 mikroliter vann. For å ha et endelig reaksjonsvolum på 500 mikroliter, tilsett 295 mikroliter vann til hver prøve.

Tilsett deretter fem mikroliter RNAasehemmer konsentrert ved 40 enhet per mikroliter for en total mengde 200 enheter per prøve og bland forsiktig. Til slutt tilsett 100 mikroliter 5X konsentrert IP-buffer til hvert rør. Prøver er nå klare for immunutfellingsreaksjonen.

Hent de magnetiske perlene kombinert med antistoff fra det roterende hjulet og spinn dem ned. Tilsett deretter 500 mikroliter av de tidligere forberedte prøvene til hver 100 mikroliter perler kombinert med de spesifikke antistoffene. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned flere ganger for å resuspendere perlene helt.

Inkuber dem eller din meRIP-reaksjon på et roterende hjul ved fire grader i løpet av to timer. Når inkubasjonen er over, snurr du ned hvert rør og plasserer dem på et magnetisk stativ i ett minutt for å tillate perleseparasjon. Fjern deretter den ubundne brøkdelen og legg den på et friskt rør og hold den for videre analyse, om nødvendig.

Fjern magneten fra stativet og bruk alle prøver på nytt i 500 mikroliter IP-buffer. Resuspend hver prøve forsiktig ved pipettering opp og ned. Sett magneten på stativet, inkuber i ett minutt, og fjern deretter forsiktig supernatanten.

Gjenta vasken to ganger, og fortsett deretter med elution. For hvert par prøver, m6A-spesifikke og kontroll, lag 225 mikroliter elutionbuffer som inneholder 20 millimolar renset m6A. Tilsett deretter 100 mikroliter elutionbuffer per prøve.

Inkuber alle prøve en time ved fire grader på en rocker. Samle deretter alle m6A beriket RNA-prøve i et friskt rør og fortsett med en andre runde med elution. Rens m6A beriket RNA med din valgte metode Og så er prøvene på dette tidspunktet klare for bibliotekforberedelse og sekvensering.

For å undersøke m5C-modifikasjonen bruker vi bisulfittkonvertering. Start eksperimentet med 500 nanogram poly-adenylert RNA. Selv om det er valgfritt å legge til prøven din 500 picogram av poly-A utarmet RNA for å sikre ribosomal representasjon og 0,5 mikroliter kommersielt tilgjengelig syntetisk sekvens vil tillate deg å vurdere bisulfitt konverteringsfrekvens ved sekvensering.

Juster prøven til et endelig volum på 20 mikroliter i vann, og tilsett deretter 130 mikroliter RNA-reagens til hver prøve. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned og spinn ned alle prøver for å sikre at det ikke er noen dråper igjen på siden av rørene. Inkuber alle prøver i en PCR-maskin i tre sykluser med denaturering 70 grader i fem minutter og bisulfittkonvertering ved 54 grader i løpet av 45 minutter.

Utfør deaminering i kolonne ved å legge direkte på en tom kolonne, 250 mikroliter RNA bindingsbuffer, 150 mikroliter av bisulfittkonbuert prøve. Bland prøven ved å pipettere opp og ned, men vær oppmerksom på at du ikke berører kolonnefiltrene. Tilsett 400 mikroliter 95-100% etanol i prøven RNA bindingsbufferblanding direkte i kolonnen.

Lukk hetten og bland umiddelbart ved inversjon. Snurr ned prøven i 30 sekunder og kast gjennomstrømningen. Vask kolonnen med vaskebuffer og tilsett deretter 200 mikroliter desulfonasjonsløsning i midten av hver kolonne.

Inkuber alle prøvene dine i 30 minutter ved romtemperatur. Snurr ned prøven i 30 sekunder og fortsett deretter med to runder med vask. Tilsett 400 mikroliter vaskebuffer i hver prøve, sentrifuger i 30 sekunder med full hastighet og kast gjennomstrømningen.

Plasser kolonnen i et nytt tomt rør og elute bisulfitten omdannet RNA til 20 mikroliter vann. Kontroller bisulfittkonverteringseffektivitet med RT-qPCR og fortsett deretter til bibliotekforberedelse og sekvensering. Ved bioinformatikkanalyse er her et eksempel på resultater du kan få med denne arbeidsflyten.

Her sammenligner vi epitranskriptomet av HIV-infiserte celler kontra ikke-infiserte celler. 24 timer etter infeksjon. I A-panelet kan du se resultatene vi får for å utforske m6A epitranscriptome.

I denne grafen plotter vi m6A beriket leser på meRIP-Seq analyse. Vi kan pent se en sinkfinger er hypermetylert 24 timer etter infeksjon. Vi utførte samme type analyse for m5C epitranscriptome-undersøkelsen i panel B.In denne grafen, hver ikke-metylert cytosin vises i rødt, mens andelen cytosin som har blitt m5C metylert, vises i blått.

Som du kan se, PHLPP1, alle tre cytosiner som er hyper-metylert 24 timers post-HIV-infeksjon. Totalt sett tillater denne arbeidsflyten å undersøke både M6A og m5C epitranscriptome av infiserte celler og kan også brukes som sådan på virale partikler. Forståelse av virusinfeksjon er i stand til å modifisere vertsepileskriptomisk landskap vil gi oss tilgang til et nytt lag av regulering.

Utredning av differensialmetylerte transkripsjoner ved virusinfeksjon vil selvfølgelig gi en verdifull ressurs for ny terapeutisk intervensjon. På lenken her nedenfor finner du vår åpne tilgangsressurs for undersøkelse av differensialmetylert transkripsjon ved HIV-infeksjon over tid.

Summary

Automatically generated

Rollen til RNA-modifikasjoner i virusinfeksjoner begynner å bli utforsket og kan markere nye viral-vert interaksjonsmekanismer. I dette arbeidet gir vi en rørledning for å undersøke m6A- og m5C RNA-modifikasjoner i sammenheng med virusinfeksjoner.

Read Article