Utforska ^m6A och ^m5C Epitranscriptomes vid virusinfektion: ett exempel med HIV

Hej, i den här videon visar vi dig hur du utforskar m6A och m5C epitranscriptomes vid virusinfektion. För att starta experimentet behöver du 50 miljoner celler för de icke-infekterade och 50 miljoner för det infekterade tillståndet. För att få en data uppsättning av hög kvalitet vid analys måste du uppnå en universell infektion.

Här infekterar vi dessa celler med en HIV-baserad vektor och mäter den viralt kodade GFP av FACS. I det här fallet hade vi 80% av infekterade celler och fortsatte med arbetsflödet som börjar med total RNA-extraktion. Så vi delade cellerna i alikvoter på 10 miljoner vardera och lyse dem i 1 ml Trizol.

Vi lade sedan till 200 mikroliter kloroform till cellen lysate och blandas av inversion. Vid denna tidpunkt låter vi lysate sitta i tre minuter vid rumstemperatur och sedan centrifugera alla prover i hög hastighet i 15 minuter vid fyra grader. Du förväntar dig att se en fasseparation i tre olika faser, som det visas här.

RNA sitter i den övre fasen, så överför försiktigt vattenfasen till ett nytt rör genom att vara uppmärksam på att inte överföra det organiska skiktet. Vid denna punkt tillsätt 0,5 ml isopropanol till vattenfasen och blanda försiktigt genom inversion. Prover kan sedan inkuberas en timme vid 80 grader för att säkerställa RNA-nederbörd.

Vid centrifugering i hög hastighet bör du kunna se en fin RNA-pellet som visas här. Kassera försiktigt supernatanten antingen genom inversion eller pipettering, var uppmärksam på att inte störa pelleten. Tvätta sedan RNA-pelleten med en ml 75% molekylär etanol.

Och virvla provet kort. Vid centrifugering, se till att du hämtar en fin vit RNA-pellet. Kassera supernatanten och låt RNA-pelleten torka i 15 minuter vid rumstemperatur.

Återanvänd varje pellet i 20 mikroliter vatten och slå alla prov från samma tillstånd tillsammans. Totalt RNA är nu redo för mRNA-isolering genom poly-A-urval. För varje prov på 75 mikrogram RNA, förbered 200 mikroliter av oligo-DT magnetiska pärlor och tvätta dem i ett ml bindningsbuffert.

Placera röret på ett magnetiskt stativ och låt pärlorna binda till magneten under en blandning. Kassera supernatanten och upprepa proceduren för en andra tvätt. Ta sedan bort pärlorna från de magnetiska stativen och försiktigt återanvända dem i 100 mikroliter av bindningsbufferten.

Förbered RNA-provet genom att dela upp dem i 75 mikrogram RNA per alikvot som återsuspenderas i 100 mikroliter vatten. Tillsätt 100 mikroliter bindningsbuffert och inkubera i två minuter vid 65 grader. Snurra sedan ner proverna och inkubera på is.

Tillsätt sedan 100 mikroliter tvättade magnetiska pärlor till varje RNA-prov och låt binda på ett roterande hjul i 15 minuter vid rumstemperatur. Vid inkubation, placera röret tillbaka i ett magnetiskt rack och låt dem inkubera i en minut. Återställ sedan supernatanten i ett nytt rör och håll den åt sidan för en andra omgång isolering.

Tvätta pärlorna två gånger med 200 mikroliter tvättbuffert och fortsätt sedan till elution. För att undkomma poly-A-valt RNA från de magnetiska pärlorna, tillsätt 20 mikroliter iskall TRIS HCl till varje prov och pipett noggrant. Inkubera sedan dina prover vid 80 grader i två minuter för att frigöra RNA från pärlorna.

Överför supernatanten som innehåller poly-A vald RNA till ett nytt rör, var försiktig med att undvika pärlor överföring. Elution-steget samt isoleringssteget bör upprepas två gånger för att öka mRNA-utbytet. mRNA är nu redo att antingen gå in i meRIP-Seq-rörledningen vid fragmenteringssteget eller gå direkt till bisulfitkonvertering.

Det första steget för att komma in i meRIP-Seq-rörledningen består i mRNA-fragmentering. För detta behöver du fem mikrogram mRNA uppdelat i alikvoter på 18 mikroliter i 0,2 ml-rör. För att säkerställa konsekventa data är det viktigt att arbeta snabbt och med endast ett fåtal exempel vid den tidpunkten.

För detta experiment har fragmentering optimerats för att erhålla fragment av en storlek mellan 115 och 200 nukleotider. Tillsätt sedan två mikroliter fragmenteringsreagens till varje rör som innehåller 18 mikroliter mRNA var försiktig vid insättning av droppen på rörväggen. Snurra ner alla prover för att möjliggöra kontakt mellan reagenset och RNA samtidigt och inkubera vid 70 grader i 15 minuter.

När inkubationen är över, stoppa reaktionen genom att tillsätta två mikroliter på 0,5 M EDTA. Vid denna tidpunkt kan du rena ditt fragmenterade mRNA med din valfria metod och gå vidare till en RNA-kvalitetskontroll av fragmentanalysator. Det här steget är valfritt, men det gör det möjligt att bedöma storleken på fragmentet innan RNA-nederbörd aktiveras.

Som ni kan se här i fjärde körfältet får vi för båda våra provfragment på cirka 150 nukleotid vardera. Vi fortsatte sedan med meRIP-Seq. Det första steget består i par A/ G magnetiska pärlor med antingen anti-m6A antikroppar eller IgG kontroller.

För varje reaktionsplan, överför 25 mikroliter magnetiska pärlor till ett nytt rör. Observera att du behöver minst ett m6A-specifikt tillstånd och ett kontrollvillkor. Tvätta varje 25 mikroliter pärlor med 250 mikroliter IP-buffert.

Återutnyttja försiktigt pärlorna genom att pipettera upp och ner och placera röret på magnetstället i en minut för att möjliggöra pärlseparation. Ta bort och kassera supernatanten, var uppmärksam på att inte aspirera de magnetiska pärlorna och upprepa tvättsteget en gång. Sätt sedan tillbaka de magnetiska pärlorna i 100 mikroliter IP-buffert per varje 25 mikroliter av originalvolymen av pärlor.

Förbered och märka ett rör per varje tillstånd. I vårt fall kommer vi att ha två rör för det infekterade tillståndet, en för m6A och en för IgG-kontroll och två rör för det icke-infekterade tillståndet. Tillsätt sedan 100 mikroliter tvättade pärlor i varje rör.

Pärlor är nu redo att kopplas ihop med specifika antikroppar eller IgG-kontroller. Tillsätt fem mikrogram av antingen specifik anti-m6A antikropp eller anti-IgG kontrollantikropp till varje rör som innehåller 100 mikroliter tvättade magnetiska pärlor. Tillåt konjugation av antikroppspärlor genom att inkubera röret 30 minuter på ett roterande hjul.

Under tiden fortsätter du med provberedning. För varje planerat tillstånd, antingen m6A-specifik eller IgG-kontroll, kommer ditt utgångsmaterial att vara 2,5 mikrogram fragmenterat mRNA-resuspended 100 mikroliter vatten. För att ha en slutlig reaktionsvolym på 500 mikroliter, tillsätt 295 mikroliter vatten till varje prov.

Tillsätt sedan fem mikroliter RNAase-hämmare som är koncentrerad till 40 enheter per mikroliter för totalt 200 enheter per prov och blanda försiktigt. Tillsätt slutligen 100 mikroliter 5X koncentrerad IP-buffert till varje rör. Proverna är nu klara för immunutfällningsreaktionen.

Hämta de magnetiska pärlorna i kombination med antikroppar från det roterande hjulet och snurra ner dem. Tillsätt sedan 500 mikroliter av de tidigare beredda proverna till varje 100 mikroliter pärlor i kombination med de specifika antikropparna. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner flera gånger för att helt återanvända pärlorna.

Inkubera dem eller din meRIP-reaktion på ett roterande hjul vid fyra grader under två timmar. När inkubationen är över, snurra ner varje rör och placera dem på ett magnetiskt rack i en minut för att tillåta pärlseparation. Ta sedan bort den obundna fraktionen och placera den på ett nytt rör och behåll den för ytterligare analys om det behövs.

Ta bort magneten från racket och återanvänd alla prover i 500 mikroliter IP-buffert. Återanvänd varje prov noggrant genom pipettering upp och ner. Sätt in magneten på racket, inkubera i en minut och ta sedan försiktigt bort supernatanten.

Upprepa tvätten två gånger och fortsätt sedan med elution. För varje par prov, m6A-specifika och kontroll, förbered 225 mikroliter elutionsbuffert innehållande 20 millimolar renad m6A. Tillsätt sedan 100 mikroliter elutionsbuffert per prov.

Inkubera alla prov en timme vid fyra grader på en rocker. Samla sedan alla m6A berikade RNA-prov i ett nytt rör och fortsätt med en andra elution. Rena m6A berikade RNA med din metod och sedan vid denna tidpunkt prover är redo för biblioteksförberedelse och sekvensering.

För att undersöka m5C-modifieringen använder vi bisulfitkonvertering. Starta experimentet med 500 nanogram polyadenylerat RNA. Även om det är valfritt, lägger du till 500 piktogram av poly-A utarmat RNA för att säkerställa ribosomal representation och 0,5 mikroliter av kommersiellt tillgänglig syntetisk sekvens gör att du kan bedöma bisulfitomvandlingshastigheten vid sekvensering.

Justera provet till en slutlig volym på 20 mikroliter i vatten och tillsätt sedan 130 mikroliter RNA-omvandlingsreagens till varje prov. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner och snurra ner allt prov för att se till att det inte finns några droppar kvar på sidan av rören. Inkubera allt prov i en PCR-maskin i tre cykler av denaturering 70 grader i fem minuter och bisulfitomvandling vid 54 grader under 45 minuter.

Utför deamination i kolonnen genom att lägga till direkt på en tom kolumn, 250 mikroliter RNA-bindningsbuffert, 150 mikroliter av ditt bisulfitomvanderade prov. Blanda provet genom pipettering upp och ner, men var uppmärksam på att inte röra kolonnfiltren. Tillsätt 400 mikroliter 95-100% etanol till provets RNA-bindningsbuffertblandning direkt i kolonnen.

Stäng locket och blanda omedelbart genom inversion. Snurra ner ditt prov i 30 sekunder och kassera genomflödet. Tvätta kolonnen med tvättbuffert och tillsätt sedan 200 mikroliter desulfonationslösning i mitten av varje kolumn.

Inkubera allt ditt prov i 30 minuter vid rumstemperatur. Snurra ner provet i 30 sekunder och fortsätt sedan med två omgångar tvätt. Tillsätt 400 mikroliter tvättbuffert till varje prov, centrifugera i 30 sekunder med full hastighet och kassera genomströmningen.

Placera kolonnen i ett nytt tomt rör och elute bisulfiten konverterade RNA till 20 mikroliter vatten. Kontrollera bisulfitkonverteringseffektiviteten med RT-qPCR och fortsätt sedan till biblioteksförberedelser och sekvensering. Vid bioinformatisk analys är här några exempel på resultat som du kan få med det här arbetsflödet.

Här jämför vi epitranskriptomet av HIV-infekterade celler jämfört med icke-infekterade celler. 24 timmar efter infektion. I A-panelen kan du se de resultat vi får när du utforskar m6A-epitranskriptomen.

I det här diagrammet ritar vi m6A berikade läsningar på meRIP-Seq analys. Vi kan fint se att ett zinkfinger är hypermetylaterat 24 timmar efter infektion. Vi utförde samma typ av analys för m5C epitranscriptome undersökning i panel B.In denna graf, varje icke-metylerad cytosin visas i rött, medan andelen cytosin som har m5C metyleras visas i blått.

Som du kan se, PHLPP1, alla tre cytosin som är hypermetylerade 24 timmar efter HIV infektion. Sammantaget tillåter detta arbetsflöde att undersöka både M6A och m5C epitranscriptome av infekterade celler och kan tillämpas som sådan på viruspartiklar också. Förståelse för virusinfektion kan ändra värd epitranscriptomic landskapet kommer att ge oss tillgång till ett nytt lager av reglering.

Undersökningen av differentiell metylerade transkriptioner vid virusinfektion kommer naturligtvis att ge en värdefull resurs för nya terapeutiska ingrepp. På länken här nedan hittar du vår open access-resurs för utredning av differentialmetylerad transkription vid HIV-infektion över tid.