Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Fibroblast avledet menneskekonstruert bindevev for screeningapplikasjoner
Chapters
Summary August 20th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Presentert her er en protokoll for å generere konstruert bindevev for en parallell kultur på 48 vev i en multi-brønn plate med doble poler, egnet for mekanistiske studier, sykdomsmodellering og screening applikasjoner. Protokollen er kompatibel med fibroblaster fra forskjellige organer og arter og eksemplifiseres her med humane primære hjertefibroblaster.
Transcript
Denne protokollen tillater fibroblast bygge og organisere sitt eget miljø under definerte mekaniske forhold. Disse resulterer i anisotrope vev med stivhet og matrisesammensetninger som kan sammenlignes med cellens naturlige miljø. Denne metoden gjør det mulig å sammenligne opptil 48 forhold parallelt.
Det er fleksibelt med hensyn til den brukte celletypen og kulturforholdene. Ved å bruke bare noen få veldefinerte komponenter, er det reproduserbart mellom laboratorier. Ved å bruke pro-fibrotiske faktorer eller antifibrotiske legemidler, kan denne protokollen brukes til å studere de underliggende prosessene og terapiene av fibrotiske sykdommer av noe slag.
Å demonstrere prosedyren vil være Alisa Degrave, en ph.d.-student fra laboratoriet vårt, og meg selv. Til å begynne med tiner du de kryo-bevarte hjertefibroblaster i et vannbad ved 37 grader Celsius i omtrent to minutter til hetteglasset sitter igjen med bare en liten mengde is. Deretter overfører du cellefjæringen dråpevis ved hjelp av en to milliliter serologisk pipette til et passende sterilt sentrifugerør som inneholder 10 milliliter fibroblast vekstmedium.
For optimal celleuthenting, skyll kryo-hetteglasset med en milliliter FGM og overfør det til sentrifugerøret. Resuspend cellene forsiktig og overføre til en cellekultur kolbe. Etterfyll FGM annenhver dag i fem dager eller til cellene har nådd 80% samløp.
Etter å ha aspirert mediet fra de dyrkede cellene, vask celler med seks milliliter PBS og aspirer, legg deretter til seks milliliter av celledissosiasjonsreagensen til cellene og inkuber til celleavløsning er synlig. Nøytraliser enzymatisk aktivitet ved å legge til seks til 12 milliliter FGM til de løsnede cellene i celletilknytningsreagenset. Pipette forsiktig opp og ned fire til åtte ganger ved hjelp av en 10 milliliter serologisk pipette for å sikre en encellet suspensjon og overføre cellene til et friskt 50 milliliter oppsamlingsrør.
Kontroller utbyttet ved hjelp av en automatisert celleteller i henhold til produsentens instruksjoner og pellet ned cellene. Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten, flikker røret for å løsne pellet og gjenopplive cellene i FGM. Deretter strekker du cellefjæringen gjennom en 40 mikrometer nettingcellesil, og deretter bruker en automatisert celleteller, vurderer cellenummer og levedyktighet ved elektrisk strømekskludering for å sikre pålitelige cellenumre før du fortsetter med konstruert bindevev eller ECT-forberedelse.
For å forberede seg på ECT, juster cellefjæringen til 8,9 millioner celler per milliliter ved 20 til 25 grader Celsius ved å legge til FGM og holde cellene på is. Overfør alle de andre rørene som inneholder de enkelte komponentene i ECT hydrogelblanding på is og forkjøl et tomt sentrifugerør på 50 milliliter for å forberede blandingen. Begynn å forberede ECT hydrogelblandingen ved å legge til komponenter som er beskrevet i teksten til det forhåndskjølte 50 milliliter sentrifugerøret for å unngå luftbobledannelse.
For det første, pipette den syreløselige kollagen type I hydrogel inn i en serologisk pipette med en bred borespiss. Juster saltinnholdet i kollagenoppløsningen ved å tilsette DMEM mens du forsiktig virvler røret for riktig blanding. For å nøytralisere pH, tilsett 0,2 molar natriumhydroksid mens du virvler røret og bekreft nøytraliseringen ved å observere den røde fargen på fenolrødindikatoren.
Tilsett deretter celleopphenget dråpevis mens du forsiktig virvler røret. Bland suspensjonen ved å røre forsiktig opp og ned bare en gang ved hjelp av en serologisk pipette med en bred borespiss for å unngå bobledannelse og minimere skjærspenningen. Virvle røret forsiktig 10 ganger for grundig blanding.
Hold sentrifugerøret som inneholder ECT hydrogelblanding på is gjennom hele støpeprosessen. Fukt en pipettespiss på en milliliter i ECT hydrogelblanding, fordel deretter 180 mikroliter hydrogelblanding jevnt i hver form av 48-brønns støpeplaten, og unngå overdreven skjærkrefter som kan påvirke integriteten til kollagenmatriseenheten og sikre at hele platen fullføres på 15 til 20 minutter. Sørg for at en komplett sløyfe dannes i formen som diskontinuerlig fordeling av ECT-blanding vil forhindre en fullstendig ECT-ringdannelse.
Unngå pipettering i den indre brønnen og forme bobler under pipettering for å sikre en jevn ECT hydrogelstøping for homogen og funksjonell vevsdannelse. Plasser forsiktig den 48-brønns støpeplaten inne i cellekulturinkubatoren for å rekonstituere ECT hydrogelblandingen i 15 til 30 minutter. Etter inkubasjon virker det gellignende og ugjennomsiktig.
Tilsett 600 mikroliter med 37 grader Celsius varm FGM per brønn langs veggen forsiktig for å unngå ECT-løsrivelse fra bunnen. Bytt ut mediet hver dag med 500 mikroliter FGM frem til analyse. På ønsket tidspunkt bruker du et stereomikroskop til å ta opp mikroskopiske bilder av ECT-ens topp- og sidevisninger.
Bruk et bildebehandlingsprogram til å utføre en linjeskanningsanalyse. Still inn en skala og bruk det rette linjeverktøyet til å spore og måle ECT-diameteren i minst seks posisjoner per arm i hvert bildeplan. Bilde den 48-brønns støpeplaten under en opptaksenhet med et integrert skannekamera plassert på en fast avstand utstyrt med en høyoppløselig monokrom bildesensor og en nær UV-lyskilde.
Utfør automatisert deteksjon av polenes spisser som inneholder fluorescerende fargestoff for å maksimere kontrasten. Mål avstanden mellom polene fra daglige poster ved hjelp av en automatisert analyse ved å kjøre de innspilte bildene på programvare for å oppdage lyse piksler med høy kontrast på en mørk bakgrunn eller et bildebehandlingsprogram. Fjern ECT fra holdestenger og sett inn en overføringskrok og ECT-sløyfe.
Overfør deretter ECT på to kroker klemt til den stasjonære armen og svingerarmen til et forlengende dynamisk mekanisk riometer utstyrt med et 37 grader Celsius herdet orgelbad fylt med PBS. Påfør uniaxial spenning med konstant lineær hastighet ved å sette riometeret til ca. 1% av den opprinnelige avstanden mellom krokene per sekund. En konstant strekkhastighet på 0,03 millimeter per sekund kan brukes med typiske ECT-dimensjoner.
Riv kraften til svingeren og start strekningen. Fortsett å registrere til punktet for ECT-brudd etter normalisering av den målte kraften ved tverrsnittsområde og plott stressstammekurven som bestemmer forskjellige biomekaniske parametere. Like før vevet starter mikrofraktur, tilsvarer den øvre grensen for den elastiske regionen utbyttepunktet og belastningen er et mål på vevselastisitet.
Plastområdet er mellom avkastningspunktet og feilpunktet. Feilpunktet tilsvarer en plutselig nedgang i stresset på grunn av brudd i vevet, og definerer den ultimate belastningen som er et mål på vevsutvisning. Det tredje målepunktet tilsvarer den maksimale styrken definert av det høyeste stresset som vevet kan bære uten å bryte under strekningen.
Motstandskraften og seigheten gitt av området under kurven tilsvarer energien som absorberes av vevet opp til henholdsvis avkastningspunktet og feilpunktet. For hver oppnådd kurve tilsvarer skråningen av den lineære delen av den elastiske regionen Youngs modulus, også kjent som elastisk modulus. Det er en mekanisk egenskap som måler vevets stivhet.
Ved hjelp av denne protokollen fulgte ECT-komprimering og sammentrekning under kontrollforhold og i nærvær av FCS noen timer etter støping og økte spesielt opp til dag fem. Når ECT ble behandlet med aktinpolymerisasjonshemmer latrunculin A, ble ECT-komprimeringen redusert som indikert av det betydelig høyere tverrsnittsområdet sammenlignet med kontroll. Sammentrekningen av vevet ble vurdert i løpet av de fem dagene av kulturen.
I fravær av Latrunculin A økte sammentrekningen gradvis opp til dag fem og nådde ca 40% sammentrekning. Imidlertid påvirket Latrunculin A-tilstedeværelse vevet sammentrekning, noe som resulterte i bare ca 20% maksimal sammentrekning. Aktinpolymerisasjonsinhibering førte til en betydelig reduksjon på ca. 50% i vevsstivheten over kontrollen.
Disse resultatene viser at aktin cytoskeletal integritet er avgjørende for ECT komprimering, sammentrekning og stivning. Det er viktig å velge en pålitelig kollagenløsning av høy kvalitet og sikre at en encellet suspensjon med høy levedyktighet brukes til å rekonstituere konstruert bindevev.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
